정성적 및 정량적 조직학적 방법을 사용하여 마우스 배아의 선천성 심장 결함 분석
Summary
이 프로토콜에서는 선천성 심장 결함과 관련된 마우스의 발달 표현형을 정성적및 정량적으로 분석하는 절차를 설명합니다.
Abstract
선천성 심장 결함 (CHD)는 모든 살아있는 출생의 1%까지 영향을 미치는 인간에 있는 출생 결함의 일반적인 모형입니다. 그러나, CHD에 대 한 근본 원인은 여전히 제대로 이해. 개발 마우스는 마우스와 인간 사이의 심장 발달 프로그램이 매우 보존되기 때문에 CHD의 연구를위한 가치있는 모델을 구성한다. 이 프로토콜은 원하는 임신 단계의 마우스 배아를 생산하는 방법, 하류 처리를 위해 심장을 분리하고 보존하는 방법, 조직학에 의한 일반적인 유형의 CHD를 식별하는 정량적 방법(예: 심실 중격)을 상세히 기술합니다. 결함, 심방 중격 결함, 특허 덕터스 동맥 동맥 및 일반적인 근육 다짐 표현형을 측정하는 정량적 조직 적 방법. 이러한 방법은 시료 준비, 수집 및 분석과 관련된 모든 단계를 명확하게 하여 과학자들이 CHD를 정확하고 재현가능하게 측정할 수 있도록 합니다.
Introduction
CHD는 인간에 있는 출생 결함의 일반적인 모형이고 출생 결함 관련 죽음의 주요한 원인1,2,3,4,5,6. 신생아의 약 90 %가 CHD에서 생존하지만, 환자의 삶과 의료 시스템에 무거운 부담을 부과, 수년에 걸쳐 상당한 이환율 및 의료 개입과 자주연관7,8,9,10. 순전히 유전 적 요인 의 외부, CHD의 원인은 제대로 이해4. 미국 심장 협회 및 기타 소스 에 따라 모든 CHD 케이스의 ~ 56-66 %를 차지하는 미확인 원인2,3,4,11. 잘 알려진 인자는 유전 적 돌연변이, CNV, 드 노보 단일 뉴클레오티드 변이체, 및 이수성염을 포함한다. 모성생활2,12,경제적 박탈, 인종13을연결하는 역학 연구에서 제시한 바와 같이 환경 및 식이 요인이 CHD에 기여하는 중요한 원천이라고 의심되며 엽산11,14 및 생리활성 지질 망막 산15,16과같은 식이 인자를 연구하여 연구한다. CHD 및 기타 심혈관 결함의 메커니즘 및 원인을 조사하는 것은 예방 전략 및 새로운 치료 옵션1,4,17,18,19를개발하는 것이 중요하다.
개발 마우스는 포유류에서 CHD를 공부하기위한 초석 모델입니다. 그러나, 심장 형태를 보존하는 해부, 발달 단계의 분석 및 CHD 관련 결함의 확인과 같은 채택된 방법 및 분석의 몇몇은, murine 심혼의 분석에 새로운 과학자를 위해 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 방법의 목표는 이러한 프로세스에 대한 정성적 및 정량적 지침을 제공하는 것입니다. 따라서, 이 프로토콜에서는 원하는 임신 단계의 배아를 생산하기 위해 시간 적 짝짓기를 수행하는 방법, 임신 한 여성을 그대로 심장 회복 (유출 관과 같은 관련 조직 포함), 심장 고정 및 준비에 대한 해부하는 방법을 설명합니다. 저온 절제, 기본 운동학 방법, 일반적인 심장 결함의 정량적 분석 및 심장 근육 다짐의 정성적 분석, CHD의 일부 유형에 대한 일반적인 전구체 표현형.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 배아 심장에서 심장 발달의 분석에 관련된 기술을 탐구합니다. 이 방법의 몇몇 제한은 현미경 화상 진찰을 가진 사례 및 기술, 필요로 할 수 있는 예비 기술에 필요한 물리적 손재주입니다. 저온 유지 작업에서 얻은 조각이 지저분하면 헤마톡실린 및 에오신 얼룩이 명확하지 않거나 현미경에서 찍은 이미지가 조명이 좋지 않은 경우 ImageJ와 함께 사용되는 방법이 작동하지 않습니다….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aguirre Lab은 수상 번호 K01HL135464에 따라 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소와 수상 번호 19IPLOI34660342에 따라 미국 심장 협회에 의해 지원됩니다.
Materials
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J – stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat – Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) – p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
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