在这里,我们描述了核糖体和相关RNA的免疫沉淀从成年雄性小鼠生殖细胞的精选群体使用RiboTag系统。战略性育种和精心的免疫沉淀产生清洁、可重复的结果,为生殖细胞的翻译提供信息,并深入了解突变表型的机制。
量化mRNA丰度差异是了解给定基因突变对细胞生理学影响的经典方法。然而,对翻译主题(整个翻译的mRNA)的差异进行特征化提供了一层额外的信息,在尝试理解RNA调节或结合蛋白的功能时特别有用。已经开发了许多方法来实现这一目标,包括核糖体分析和多体分析。然而,这两种方法都面临重大技术挑战,除非与额外的分拣方法相结合,否则不能应用于组织内的特定细胞群。相反,RiboTag 方法是一种基于基因、高效且技术简单的替代方法,它允许从特定细胞群中识别核糖体相关 RNA,而无需添加排序步骤,前提是可以使用适用的细胞特异性Cre驱动程序。该方法包括育种,以生成遗传模型、样本收集、免疫沉淀和下游RNA分析。在这里,我们概述了在成年雄性小鼠生殖细胞突变的这一过程,用于男性生育所需的RNA结合蛋白。特别注意育种的考虑,重点是有效的菌群管理和产生正确的遗传背景和免疫沉淀,以减少背景和优化产量。还讨论了故障排除选项、其他确认实验和潜在的下游应用。提出的遗传工具和分子协议是描述复杂组织或具有异常mRNA存储和翻译系统的特定细胞群的核糖体相关RNA的有力方法,目的是告知突变表型的分子驱动因素。
通过微阵列或RNA测序对细胞或组织的RNA丰度进行分析,已被证明是了解突变表型分子驱动因素的有力工具。然而,这些相对不完整的分析工具可能无法告知细胞的生理或蛋白酶,特别是在许多mRNA在翻译前储存的系统,如神经和生殖细胞。在这些系统中,定义被主动转化为蛋白质的mRNA种群,或细胞的翻译,可能是细胞实际生理状态1,2的更好指标。例如,处于不同发育阶段的生殖细胞转录了RNA,这些RNA被储存在以后的翻译中,由发育3或信号线索4驱动。这个过程通过mRNA编码蛋白胺得到证明,其中mRNA转录本在蛋白质制造前数天可检测到,即1、2、5、6。同样,神经细胞在细胞核中转录RNA并将其输送到斧子下,就像β-actin7一样。除了这些专门的细胞系统外,稳态转录在RNA存储、核糖体生物发生或mRNA转化受到影响的模型中也不太可能具有信息性。多个其他因素也可能影响细胞的稳态RNA池,包括mRNA衰变和RNA结合蛋白的活性。在这些情况下,在主动转化下分析核糖体相关RNA或mRNA的可靠工具更有可能产生与生物学相关的结果。
为此,已经开发了几种方法来识别核糖体相关或主动翻译的消息。聚体分析,它提供了核糖体相关转录的快照,已经使用了几十年来分离与核糖体亚单位或单体、二核糖体和多核糖体复合物3相关的完整RNA。简单地说,收集的细胞裂解物被应用于线性蔗糖梯度,并高速离心,从而分离核糖体亚单位、完整的核糖体和多体体的大小。传统上,这种技术已经应用于研究一个或几个mRNA,但最近这种方法已经结合RNA-seq研究,以阐明潜在的转化调节器8,9虽然一种强大的方法来区分主动翻译和非翻译mRNA10,多部分分析确实需要耗时的方法(梯度分馏和超离心),并可能需要大量的样品分析稀有细胞人口具有挑战性的。
检查翻译体的另一种方法是核糖体分析,它识别与核糖体直接相关的转录部分。简而言之,核糖体相关RNA片段通过RNase保护测定产生,通过蔗糖梯度分离的单个核糖体复合物,以及分离并转化为RNA-seq标记的相关RNA片段,可适应深度测序11。核糖体分析的关键好处之一是能够确定核糖体在隔离时的具体位置,从而能够识别翻译起始点,计算核糖体占用和分布,以及识别核糖体失位12。然而,这种方法有几个固有的缺点,包括设备需求(梯度分数和超离心),一个相对复杂的协议,需要广泛的故障排除,和计算问题不容易由缺乏经验的用户11处理。重要的是,核糖体分析主要应用于培养中的分离细胞,需要大量的材料,这使得其应用于混合细胞型组织或体内分类细胞。
桑兹等人于2009年13月开发的哺乳动物RiboTag方法消除了多体体和核糖体分析所固有的许多问题。在这种方法中,核糖体相关RNA可以从特定的细胞类型中分离出来,允许研究复杂组织中细胞型特异性的翻译,而无需额外的隔离技术和专用设备,这是其他方法13、14中所必需的。RiboTag方法的基础是转基因小鼠模型(RiboTag),它携带一个经过修饰的60S核糖体亚单位蛋白基因Rpl22的位点。此位点 (Rpl22-HA) 包括一个浮点端外子,然后是一个附加的终端外子副本,经过修正后,在编码区域内包含一个 C 端血凝素 (HA) 标记。当交叉到鼠标表示细胞特定的Cre重组酶时,絮状的外子被移除,允许以细胞特定的方式表达HA标记的RPL22(图1)。然后,HA 标记可用于免疫沉淀 (IP) 核糖体及其从所选细胞类型相关的 RNA。
除了开发该技术的最初出版物外,其他几个实验室还利用了RiboTag模型。各种组织,如小鼠塞尔托利和莱迪格细胞15,微胶质16,神经元17,18,卵母细胞19,和培养细胞20已被分析和研究。虽然该协议显然能够成功地分离核糖体和不同组织类型的相关RNA,但仍有需要改进的领域,特别是当应用于突变系统时。特别是,对新鲜组织的共同依赖会导致技术变异增加,从而大大降低分析能力。其次,当高免疫沉淀背景发生在非Cre重组细胞类型中时,对差异转换目标的自信识别更具挑战性,如之前报道的13。虽然Sanz等人设计了该技术的基本前提,但斯奈德实验室在这份手稿中提出了协议优化,以减少这些顾虑,使该方法更加实用和高效。
本文的目的是解释繁殖小鼠表达细胞特异性HA标记核糖体、从闪冻样品中免疫沉淀这些核糖体以及纯化其相关RNA以进行进一步下游分析的步骤。由于哺乳动物雄性生殖细胞和不育突变的研究提供了独特的挑战,已努力阐明该技术可以适应其他细胞系统的方法。
了解特定细胞类型的翻译体对于更准确地理解正常或突变状态的细胞的生理是无价的。特殊益处在翻译与转录分离的系统中可见,例如在神经组织中,翻译发生在离转录很远的地方,或者在转录发生很久之前发生转录的生殖细胞中。与其他翻译体分析方法相比,RiboTag系统的最大优势来自于使用Cre重组酶系统。这允许自由定位具有相关Cre驱动程序的任何单元格群。其次,本文所述的 RiboTag IP 是有效的,在技术上比多体或核糖体分析少得多,而且更不费时。最后,RiboTag IP 可在台面轻松执行。
此协议中有许多关键步骤。其中最主要的是建立RiboTag小鼠线和产生实验动物进行研究。至于所有基因模型,应仔细跟踪小鼠群落内的个体,以及仔细的基因分型方案。PCR基因分型,根据Sanz等人应包括针对野生型外生4的loxP位点5’的引物,以区分野生型等位基因(260 bp)和突变体(290bp)13。对于生殖细胞模型中的RiboTag分析,应遵循非常具体的育种要求。首先,在导致不育的突变体的情况下,深思熟虑的育种策略应包括优化中间代和实验代中具有所需基因型的后代数量的方法。其次,对于生殖细胞特异性克雷斯,鉴于生殖细胞对Cre毒性的敏感性,应注意Cre-zygosity。 在生殖细胞中,高浓度的Cre蛋白会产生有害影响22,禁止在繁殖方案中使用Cre/Cre动物。最后,当使用生殖细胞Cres时,重要的是从Cre分离出RiboTag等位基因,直到最后一代作为中间代生殖细胞中的Cre表达,导致后代在全球范围内表达Rpl22-HA。
无论细胞系统如何,可以进行一些推荐的控制,以验证Cre表达和特异性的鲁棒性。使用多种方法可以确定您的 Cre的正确表达和Rpl22-HA的预期切除。首先,从实验动物中分离出来的组织可以使用免疫组织化学或免疫荧光15染色,用于HA。此方法是最佳方法,因为它不需要先验地了解目标细胞类型中的已翻译 mRNA。第二种方法(图 6中演示的一个示例)需要了解目标单元类型中的转换调控消息。在这种方法中,可以使用IPed与输入RNA的定量PCR从选定的Cre-驱动程序中确认已知翻译调节的mRNA的富集。同样,通过将Cre_/Rpl22+样本(阳性对照)与Cre-/Rpl22+或Cre_/Rpl22-样本进行比较,可以确认强大的Rpl22-HA表达式,这些样本可作为有效的阴性对照(参见图 3)。这些比较可以通过对总IPed RNA进行,也可以对由qRT-PCR或其他一些定量方法评估的已知翻译调节的mRNA进行浓缩。
协议执行中的常见问题往往只有在RNA产量出乎意料地低或高时才变得明显。这些失败的最常见原因是个人基因分型不正确。我们建议从采集的样本中保留额外的组织,以确认所有样品的基因型,以防出现意外的RNA。一旦得到确认,应考虑其他可能性,包括RNase污染或样品降解的可能性。在实验室内仔细存储、处理和维护无RNase区域,可以大大减少或消除这些问题。虽然RNA分离问题是该协议中的另一个潜在问题,但商业试剂盒的使用大大减少了这个问题,但应注意确保它们保持为无RNA酶,并且不包含过期的解决方案。最后,与所有基于抗体的程序一样,批次、储存条件、浓度甚至装运的变化都有可能对抗体的质量以及随后的下拉成功产生负面影响。因此,经过仔细和反复的测试,我们选择了最一致和最有效的抗体。
该协议包含相对于其他已发布的 RiboTag 协议的两个主要修改,可显著提高成功的可能性。一种是使用闪光冷冻组织的能力,从而缓解涉及批次、技术人员或技术运行变化的任何问题。可以收集和存储样品,以便一次从所有样品中分离 HA-核糖体,从而降低可能是主要变异源。其次,预清除步骤的加入大大减少了 RiboTag 系统其他用户报告的背景类型。最近,Sanz等人的一份协议报告显示,由于非克细胞14的核糖体相关记录量丰富,存在高背景。我们的协议通过包括预清除步骤来解决此问题,从而有效地消除Cre阴性 IP 样品中是否存在 RNA。
与所有系统一样,应牢记 RiboTag 系统固有的局限性。当使用未描述的Cre驱动器时,应在实验样品生产之前对表达进行分析。从翻译的角度来看,应该注意这种方法的几个细微差别。首先,RiboTag 不允许区分准备翻译的 mRNA 和那些积极翻译的 mRNA。因此,目前基于RiboTag的方法不允许将翻译效率量化为单个mRNA的函数。如果对翻译效率感兴趣,如果 RiboTag 方法与其他翻译体分析工具(如多体分析)结合使用,则可以根据具体单元格进行测量。其次,考虑个体或基因型依赖性差异引起的总RNA丰度变化至关重要。正因如此,在免疫沉淀过程中仔细分离输入RNA,从每个样本中提取的样本在任何下游分析过程中保持配对。最后,关于基于RiboTag的分析,应该记住,与核糖体的关联并不一定证明翻译正在发生。应执行次要分析方法,以确认目标中的平移调节。
该协议使用RiboTag模型描述了核糖体相关RNA与雄性小鼠生殖细胞的分离。不考虑小鼠的繁殖和样本采集,协议需要两天,第一天三个小时,最好在下午完成,一个通宵孵化,然后五个小时的工作,第二天早上。强烈建议提前准备库存溶液(HB和HSWB)和组织研磨。该协议的整体成功取决于正确的基因分型和严格的无RNase条件。能够检查特定细胞类型的翻译体将允许未来的研究更好地了解转录、翻译和无数细胞类型和突变背景中的蛋白酶之间的关系。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由NIH资助NICHD R00HD083521给EMS,以及罗格斯大学向EMS提供内部支持。
1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
Dissection scissors | Preference of researcher | ||
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
Heat block | Preference of researcher | ||
Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
NP-40 Alternative – CAS 9016-45-9 – Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |