यहां, हम रिबोटैग सिस्टम का उपयोग करके वयस्क पुरुष माउस रोगाणु कोशिकाओं की चुनिंदा आबादी से राइबोसोम और संबद्ध आरएनए के इम्यूनोप्रिसिप्रिटेशन का वर्णन करते हैं। रणनीतिक प्रजनन और सावधानीपूर्वक इम्यूनोप्रिसिप्रिशन के परिणामस्वरूप साफ, प्रजनन योग्य परिणाम होते हैं जो रोगाणु कोशिका अनुवाद पर सूचित करते हैं और उत्परिवर्ती फेनोटाइप के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।
एमआरएनए बहुतायत में अंतर का परिमाणकरण सेल फिजियोलॉजी पर दिए गए जीन उत्परिवर्तन के प्रभाव को समझने के लिए एक क्लासिक दृष्टिकोण है। हालांकि, अनुवादमें अंतर की विशेषता (अनुवादित mRNAs के पूरे) विशेष रूप से उपयोगी जानकारी की एक अतिरिक्त परत प्रदान करता है जब आरएनए विनियमन या बाध्यकारी प्रोटीन के कार्य को समझने की कोशिश कर रहा । इसे पूरा करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, जिनमें राइबोसोम प्रोफाइलिंग और पॉलीसम विश्लेषण शामिल हैं। हालांकि, दोनों विधियों महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौतियों ले और एक ऊतक के भीतर विशिष्ट सेल आबादी के लिए लागू नहीं किया जा सकता है जब तक अतिरिक्त छंटाई तरीकों के साथ संयुक्त । इसके विपरीत, रिबोटैग विधि एक आनुवंशिक आधारित, कुशल और तकनीकी रूप से सीधा विकल्प है जो अतिरिक्त छंटाई चरणों के बिना विशिष्ट सेल आबादी से राइबोसोम संबद्ध आरएनए की पहचान की अनुमति देता है, बशर्ते एक लागू सेल-विशिष्ट क्रे ड्राइवर उपलब्ध हो। इस विधि में आनुवंशिक मॉडल, नमूना संग्रह, इम्यूनोप्रिसिप्रिशन और डाउनस्ट्रीम आरएनए विश्लेषण उत्पन्न करने के लिए प्रजनन शामिल है। यहां, हम वयस्क पुरुष माउस रोगाणु कोशिकाओं में इस प्रक्रिया को पुरुष प्रजनन क्षमता के लिए आवश्यक आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के लिए उत्परिवर्ती की रूपरेखा तैयार करते हैं। पृष्ठभूमि को कम करने और आउटपुट को अनुकूलित करने के लिए कुशल कॉलोनी प्रबंधन और सही आनुवंशिक पृष्ठभूमि और इम्यूनोप्रिसिप्रिशन की पीढ़ी पर ध्यान केंद्रित करने के साथ प्रजनन के लिए विचारों पर विशेष ध्यान दिया जाता है। समस्या निवारण विकल्पों की चर्चा, अतिरिक्त पुष्टित्मक प्रयोग, और संभावित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगभी शामिल हैं। प्रस्तुत आनुवंशिक उपकरण और आणविक प्रोटोकॉल जटिल ऊतकों में विशिष्ट सेल आबादी के राइबोसोम-संबद्ध आरएनए का वर्णन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका का प्रतिनिधित्व करते हैं या सिस्टम में उत्परिवर्ती फेनोटाइप के आणविक ड्राइवरों को सूचित करने के लक्ष्य के साथ अदुमराह mRNA भंडारण और अनुवाद के साथ।
एक कोशिका या ऊतक की आरएनए बहुतायत का विश्लेषण, जैसा कि माइक्रोरे या आरएनए-अनुक्रमण द्वारा जांच की गई है, ने उत्परिवर्ती फेनोटाइप के आणविक ड्राइवरों को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित किया है। हालांकि, ये अपेक्षाकृत अधूरे विश्लेषण उपकरण कोशिका के शरीर विज्ञान या प्रोटेम पर सूचित नहीं कर सकते हैं, विशेष रूप से उन प्रणालियों में जहां तंत्रिका और रोगाणु कोशिकाओं जैसे अनुवाद से पहले कई mRNAs संग्रहीत किए जाते हैं। इन प्रणालियों में, mRNAs की आबादी को परिभाषित करने के सक्रिय रूप से प्रोटीन, या सेल के अनुवाद में अनुवाद किया जा रहा है, सेल के वास्तविक शारीरिक राज्य1,2का एक बेहतर संकेतक हो सकता है । उदाहरण के लिए, विकास के विभिन्न चरणों में रोगाणु कोशिकाएं आरएनए को टाइप करती हैं जो बाद में अनुवाद के लिए संग्रहीत होती हैं, या तो विकासात्मक3 या सिग्नलिंग संकेतों से प्रेरित होतीहैं। इस प्रक्रिया का उदाहरण एमआरएनसीए एनकोडिंग प्रोटामाइंस द्वारा किया जाता है, जिसमें प्रोटीन 1,2,5,6बनाए जाने से पहले एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट का पता लगाने योग्य दिन होता है। इसी तरह, तंत्रिका कोशिकाएं नाभिक में आरएनए को टाइप करती हैं और इसे एक्सॉन के नीचे ले जाती हैं, जैसा कि 7 के साथ मामलाहै। इन विशेष सेल सिस्टम के अलावा, स्थिर-राज्य प्रतिलेखन मॉडलों में जानकारीपूर्ण होने की संभावना नहीं है जहां आरएनए भंडारण, राइबोसोम बायोजेनेसिस, या एमआरएनए अनुवाद प्रभावित होते हैं। कई अन्य कारक भी एक सेल के स्थिर राज्य आरएनए पूल को प्रभावित कर सकते हैं जिसमें एमआरएनए क्षय और आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन की गतिविधि शामिल है। इन मामलों में, सक्रिय अनुवाद के तहत राइबोसोम-संबद्ध आरएनए या आरएमनए का विश्लेषण करने के लिए मजबूत उपकरण जैविक रूप से प्रासंगिक परिणाम प्राप्त करने की अधिक संभावना रखते हैं।
इस उद्देश्य के लिए, राइबोसोम से जुड़े या सक्रिय रूप से अनुवादित संदेशों की पहचान करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। पॉलीसम प्रोफाइलिंग, जो राइबोसोम संबद्ध प्रतिलिपियों का एक स्नैपशॉट प्रदान करता है, कई दशकों से राइबोसोमल उपइकाइयों या मोनो-, डी-और पॉली-राइबोसोम परिसरों3से जुड़े बरकरार आरएनए को अलग करने के लिए उपयोग किया गया है। संक्षेप में, एकत्र किए गए सेल लिसेट्स को एक रैखिक सुक्रोज ग्रेडिएंट पर लागू किया जाता है और उच्च गति के रूप में केंद्रित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप राइबोसोम उपइकाइयों, बरकरार राइबोसोम और पॉलीसोम ्स को आकार से अलग किया जाता है। परंपरागत रूप से, इस तकनीक को एक या कुछ mRNAs का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है, लेकिन हाल ही में इस विधि को आरएनए-सीक्यू अध्ययनों के साथ जोड़ा गया है ताकि संभावित अनुवादात्मक नियामकों8,9 के कार्य को स्पष्ट किया जा सके जबकि सक्रिय रूप से अनुवाद और गैर-अनुवाद करने वाले mRNAs10के बीच अंतर करने का एक शक्तिशाली तरीका, पॉलीसोम प्रोफाइलिंग के लिए समय लेने वाले तरीकों (ढाल अंश और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज) की आवश्यकता होती है आबादी चुनौतीपूर्ण।
अनुवाद की जांच करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण राइबोसोम प्रोफाइलिंग है, जो सीधे राइबोसोम से जुड़े टेप के कुछ हिस्सों की पहचान करता है। संक्षेप में, राइबोसोम संबद्ध आरएनए टुकड़े RNase सुरक्षा परख के माध्यम से उत्पन्न होते हैं, सुक्रोज ढाल के माध्यम से अलग व्यक्तिगत राइबोसोम परिसर, और संबद्ध आरएनए टुकड़े अलग और आरएनए-सीक्यू टैग में परिवर्तित गहरे अनुक्रमण11के लिए उत्तरदायी हैं। राइबोसोम प्रोफाइलिंग के प्रमुख लाभों में से एक अलगाव के समय राइबोसोम्स के विशिष्ट स्थानों को निर्धारित करने की क्षमता है जो अनुवाद शुरू साइटों की पहचान, राइबोसोमल अधिभोग और वितरण की गणना और राइबोसोम स्टालों की पहचान12की अनुमति देता है। हालांकि, इस विधि में उपकरणों की जरूरत (ढाल आंशिक और अल्ट्रासेंट्रोफ्यूज) सहित कई अंतर्निहित कमियां हैं, एक अपेक्षाकृत जटिल प्रोटोकॉल जिसके लिए व्यापक समस्या निवारण की आवश्यकता होती है, और कम्प्यूटेशनल मुद्दों को अनुभवहीन उपयोगकर्ता11द्वारा आसानी से नहीं संभाला जाता है। महत्वपूर्ण बात, राइबोसोम प्रोफाइलिंग मुख्य रूप से संस्कृति में अलग कोशिकाओं पर लागू होती है और पर्याप्त सामग्री की आवश्यकता होती है, जिससे वीवो लिमिटेड में से मिश्रित सेल-प्रकार के ऊतकों या क्रमबद्ध कोशिकाओं के लिए इसका आवेदन होता है।
200913में सैंज एट अल द्वारा विकसित स्तनधारी रिबोटैग विधि, बहुरूप और राइबोसोम प्रोफाइलिंग दोनों के लिए निहित कई मुद्दों को समाप्त करती है। इस विधि में, राइबोसोम से जुड़े आरएनए को विशिष्ट सेल प्रकारों से अलग किया जा सकता है जो अतिरिक्त अलगाव तकनीकों और विशेष उपकरणों के बिना जटिल ऊतकों में सेल-प्रकार विशिष्ट अनुवादों की जांच की अनुमति देते हैं, जैसा कि अन्य तरीकों13,14में आवश्यक है। रिबोटैग विधि का आधार एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल (रिबोटैग) है जो 60 S राइबोसोमल सबयूनिट प्रोटीन जीन Rpl22के लिए एक संशोधित लोकस ले जाता है। इस लोकस(Rpl22-HA)में एक floxed टर्मिनल एक्सॉन शामिल है जिसके बाद टर्मिनल एक्सोन की एक अतिरिक्त प्रति संशोधित की गई है जिसमें कोडिंग क्षेत्र के भीतर सी-टर्मिनल हेमग्ग्ग्लूटिनिन (एचए) टैग शामिल है। जब एक सेल-विशिष्ट क्रे Recombinase व्यक्त माउस को पार कर, floxed एक्सोन एक सेल विशिष्ट तरीके से हा टैग RPL22 की अभिव्यक्ति की अनुमति हटा दिया जाता है(चित्रा 1)। एचए टैग का उपयोग चयनित सेल प्रकार से इम्यूनोप्रीसिपिट (आईपी) राइबोसोम और उनके संबद्ध आरएनए के लिए किया जा सकता है।
तकनीक विकसित करने वाले प्रारंभिक प्रकाशन के अलावा, कई अन्य प्रयोगशालाओं ने रिबोटैग मॉडल का उपयोग किया है। माउस सर्टली और लेडिग कोशिकाओं15,माइक्रोग्लिया16,न्यूरॉन्स17,18,ओसाइट्स19और सुसंस्कृत कोशिकाओं20 जैसे विविध ऊतकों को प्रोफाइल और अध्ययन किया गया है। हालांकि यह प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से राइबोसोम ्स को सफलतापूर्वक अलग करने में सक्षम है और एक विविध ऊतक प्रकारों में संबद्ध आरएनए अभी भी सुधार की आवश्यकता वाले क्षेत्र हैं, खासकर जब उत्परिवर्ती प्रणालियों पर लागू किया जाता है। विशेष रूप से, ताजा ऊतक पर आम निर्भरता तकनीकी भिन्नता में वृद्धि होती है जो विश्लेषण की शक्ति को बहुत कम कर सकती है। दूसरे, विभेदित अनुवादित लक्ष्यों की आत्मविश्वासी पहचान को और अधिक चुनौतीपूर्ण बनाया जाता है जब उच्च इम्यूनोप्रिप्रिसिप्रिफिकेशन पृष्ठभूमिगैर-क्रे पुनर्संयोजन सेल प्रकारों से होती है जैसा कि पहले13की रिपोर्ट की गई थी। जबकि Sanz एट अल तकनीक के मूल आधार इंजीनियर, इस पांडुलिपि में Snyder प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के अनुकूलन प्रस्तुत करने के लिए इन चिंताओं को कम, विधि और अधिक व्यावहारिक और कुशल प्रतिपादन ।
इस लेख का उद्देश्य कोशिका-विशिष्ट एचए-टैग किए गए राइबोसोम ्स व्यक्त करने वाले चूहों के प्रजनन के लिए कदमों की व्याख्या करना, फ्लैश-फ्रोजन नमूनों से इन राइबोसोम्स को इम्यूनोप्रिसिबिट करने और आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उनके संबद्ध आरएनए को शुद्ध करना है। स्तनधारी पुरुष रोगाणु कोशिका और प्रजनन उत्परिवर्तन का अध्ययन अद्वितीय चुनौतियां प्रदान करते हैं, इस तकनीक को अन्य सेल प्रणालियों के अनुकूल बनाने के तरीकों को रोशन करने के प्रयास किए गए हैं।
सामान्य या उत्परिवर्ती अवस्था में कोशिका के शरीर विज्ञान को अधिक सटीक रूप से समझने के लिए किसी विशेष कोशिका प्रकार के अनुवाद को समझना अमूल्य है। विशेष लाभ सिस्टम में देखा जाता है जिसमें अनुवाद प्रतिलेखन से अयुग्मित होता है, जैसे तंत्रिका ऊतक में जहां अनुवाद प्रतिलेखन से बहुत दूर होता है, या रोगाणु कोशिकाओं में जहां अनुवाद से बहुत पहले होता है। अनुवाद विश्लेषण के अन्य तरीकों के सापेक्ष, रिबोटैग सिस्टम का सबसे बड़ा लाभ क्रे रिकॉम्बिनेज़ सिस्टम के उपयोग से आता है। यह स्वतंत्रता किसी भी सेल आबादी है कि एक प्रासंगिक सीआरई चालक है लक्षित करने की अनुमति देता है । दूसरे, रिबोटैग आईपी जैसा कि यहां वर्णित है, प्रभावी है और पॉलीसम या राइबोसोम प्रोफाइलिंग की तुलना में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला बहुत कम है। अंत में, रिबटैग आईपी आसानी से बेंचटॉप पर प्रदर्शन किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं । उनमें से प्रमुख रिबोटैग माउस लाइन की स्थापना और अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक जानवरों की पीढ़ी है । सभी आनुवंशिक मॉडलों के लिए, माउस कॉलोनी के भीतर व्यक्तियों की सावधानीपूर्वक ट्रैकिंग के साथ-साथ सावधान जेनोटपिंग प्रोटोकॉल लागू किया जाना चाहिए। सैंज एट अल के अनुसार पीसीआर गेनोटाइपिंग में वाइल्डटाइप एक्सॉन 4 के लोक्सपी साइट 5 ‘ को लक्षित करने वाले प्राइमर शामिल होने चाहिए ताकि वाइल्डटाइप एलील्स (260 बीपी) और उत्परिवर्ती (290 बीपी)13के बीच अंतर किया जा सके। रोगाणु सेल मॉडल में रिबोटैग विश्लेषण के मामले के लिए, बहुत विशिष्ट प्रजनन आवश्यकताओं का पालन किया जाना चाहिए। सबसे पहले, म्यूटेंट के मामले में, जिसके परिणामस्वरूप प्रजनन, विचारशील प्रजनन रणनीतियों में मध्यवर्ती और प्रयोगात्मक पीढ़ियों में वांछित जीनोटाइप के साथ संतानों की संख्या को अनुकूलित करने के तरीके शामिल होने चाहिए। दूसरा, रोगाणु कोशिका विशिष्ट क्रेसके मामले में, क्रे विषाक्तता के लिए रोगाणु कोशिकाओं की संवेदनशीलता को देखते हुए क्रे-zygosity के बारे में देखभाल की जानी चाहिए । रोगाणु कोशिका में, सीआरई प्रोटीन के उच्च स्तर पर प्रजनन योजना में क्रे/क्रे जानवरों के उपयोग पर रोक लगाते हुए22हानिकारक प्रभाव हो सकते हैं । अंत में, रोगाणु कोशिका क्रेएस का उपयोग करते समय, एक मध्यवर्ती पीढ़ी के रोगाणु कोशिका में क्रे अभिव्यक्ति के रूप में अंतिम पीढ़ी तक क्रे से रिबोटैग एलील को अलग करना महत्वपूर्ण है, जिसके परिणामस्वरूप विश्व स्तर पर Rpl22-HA व्यक्त करने वाली संतान होगी।
सेल सिस्टम की परवाह किए बिना, कई अनुशंसित नियंत्रण क्रे अभिव्यक्ति और विशिष्टता दोनों की मजबूती को सत्यापित करने के लिए संभव हैं। अपने सीआरई की उचित अभिव्यक्ति और Rpl22-HA की अपेक्षित एक्सीक्शन कई तरीकों का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। पहले, प्रयोगात्मक जानवरों से अलग ऊतक को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इम्यूनोलुनोरेंस15का उपयोग करके एचए के लिए दाग दिया जा सकता है। यह विधि इष्टतम है कि इसके लिए लक्ष्य सेल प्रकारों में अनुवादित mRNA के प्राथमिकताज्ञान की आवश्यकता नहीं है। दूसरी विधि, जिसका एक उदाहरण चित्र 6में प्रदर्शित किया जाता है, लक्ष्य सेल प्रकार में अनुवाद ित संदेशों के कुछ ज्ञान की आवश्यकता है । इस विधि में, एक ज्ञात अनुवाद विनियमित एमआरएनए के लिए संवर्धन की पुष्टि चयनित क्रे-ड्राइवरसे आईपीईडी बनाम इनपुट आरएनए की मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करके की जा सकती है। इसी तरह, मजबूत Rpl22-HA अभिव्यक्ति की पुष्टि क्रे +/Rpl22 + नमूनों (सकारात्मक नियंत्रण) की तुलना में या तो क्रे-/Rpl22 + या Cre+/Rpl22-नमूनों के साथ की जा सकती है जो प्रभावी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करते हैं (चित्रा 3देखें) । ये तुलना या तो कुल आईपेड आरएनए या संवर्धन पर क्यूआरटी-पीसीआर या कुछ अन्य मात्रात्मक विधि द्वारा मूल्यांकन किए गए ज्ञात अनुवाद रूप से विनियमित एमआरएनए के लिए की जा सकती है।
प्रोटोकॉल के निष्पादन में आम समस्याएं केवल स्पष्ट हो जाती हैं जब आरएनए उपज अप्रत्याशित रूप से कम या उच्च होती है। इन विफलताओं के लिए सबसे आम कारण व्यक्तियों के गलत genotyping से उत्पन्न होता है। हम अप्रत्याशित आरएनए पैदावार के मामले में सभी नमूनों के जीनोटाइप की पुष्टि करने के लिए एकत्र किए गए नमूने से अतिरिक्त ऊतक को बनाए रखने की सलाह देते हैं। एक बार पुष्टि होने के बाद, अन्य संभावनाओं पर विचार किया जाना चाहिए जिसमें RNase संदूषण या नमूना क्षरण की संभावना शामिल है। प्रयोगशाला के भीतर RNase मुक्त क्षेत्रों के सावधानीपूर्वक नमूना भंडारण और हैंडलिंग और रखरखाव इन मुद्दों को बहुत कम या खत्म कर सकते हैं। हालांकि आरएनए अलगाव के मुद्दों को इस प्रोटोकॉल में एक और संभावित समस्या है, वाणिज्यिक किट का उपयोग बहुत इस मुद्दे को कम कर देता है, हालांकि देखभाल के लिए सुनिश्चित करें कि वे RNase मुक्त के रूप में बनाए रखा जाता है और कोई समाप्त समाधान होते है लिया जाना चाहिए । अंत में, सभी एंटीबॉडी-आधारित प्रक्रियाओं के साथ, बहुत में भिन्नता, भंडारण की स्थिति, एकाग्रता, या यहां तक कि शिपिंग में एंटीबॉडी की गुणवत्ता और पुलडाउन की बाद की सफलता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करने की क्षमता है। नतीजतन, सावधान और दोहराया परीक्षण के बाद, हम सबसे सुसंगत और कुशल एंटीबॉडी उपलब्ध चुना ।
इस प्रोटोकॉल में अन्य प्रकाशित रिबोटैग प्रोटोकॉल के सापेक्ष दो प्रमुख संशोधन शामिल हैं जो सफलता की संभावना को काफी बढ़ाते हैं। एक फ्लैश जमे हुए ऊतक का उपयोग करने की क्षमता है, जिससे किसी भी बहुत, तकनीशियन, या तकनीकी रन विविधताओं से जुड़े मुद्दों को कम करने । नमूनों को एकत्र किया जा सकता है और एक बार में सभी नमूनों से हा-राइबोसोम्स के अलगाव की अनुमति संग्रहीत किया जा सकता है, जो भिन्नता के प्रमुख स्रोत हो सकते हैं। दूसरा, प्रीक्लियर स्टेप के अलावा रिबोटैग सिस्टम के अन्य उपयोगकर्ताओं द्वारा रिपोर्ट की गई पृष्ठभूमि की तरह को काफी कम कर देता है। हाल ही में, Sanz एट अल द्वारा एक प्रोटोकॉल रिपोर्ट गैरक्रेसंचालित कोशिकाओं14से राइबोसोम से जुड़े टेप की बहुतायत के कारण उच्च पृष्ठभूमि की उपस्थिति को इंगित करता है । हमारा प्रोटोकॉल एक प्रीक्लियरिंग कदम को शामिल करके इस मुद्दे को उपचार करता है, प्रभावी रूप से क्रे नकारात्मक आईपी नमूनों में आरएनए की उपस्थिति को नष्ट करता है।
सभी प्रणालियों की तरह, रिबोटैग सिस्टम की अंतर्निहित सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। जब अविशेषता सीआरई ड्राइवरों का उपयोग करते हैं, तो अभिव्यक्ति का विश्लेषण प्रयोगात्मक नमूना उत्पादन से पहले किया जाना चाहिए। अनुवाद के नजरिए से, इस विधि की कई बारीकियों को नोट किया जाना चाहिए। सबसे पहले, रिबोटैग अनुवाद करने के लिए तैयार mRNAs और सक्रिय रूप से अनुवाद करने वालों के बीच भेदभाव की अनुमति नहीं देता है। इस प्रकार, वर्तमान रिबोटैग-आधारित विधियां अनुवाद दक्षता के मात्राकरण को व्यक्तिगत mRNAs के कार्य के रूप में अनुमति नहीं देती हैं। यदि अनुवाद दक्षता रुचि की है, तो इसे सेल-विशिष्ट आधार पर मापा जा सकता है यदि रिबोटैग विधि को पॉलीसम प्रोफाइलिंग जैसे अन्य अनुवाद विश्लेषण उपकरणों के साथ जोड़ा जाता है। दूसरे, व्यक्तिगत या जीनोटाइप निर्भर विचरण से उपजी कुल आरएनए बहुतायत परिवर्तनों को ध्यान में रखना मौलिक है । यही कारण है कि इनपुट आरएनए के सावधानीपूर्वक अलगाव इम्यूनोप्रिसिप्रिशन के साथ और प्रत्येक से प्राप्त नमूनों को किसी भी डाउनस्ट्रीम विश्लेषण ों में जोड़ा जाता है। अंत में, और में RiboTag आधारित विश्लेषण के संबंध में, यह याद किया जाना चाहिए कि एक राइबोसोम के साथ सहयोग जरूरी साबित नहीं होता अनुवाद हो रहा है । ब्याज के लक्ष्यों में अनुवादविनियमन की पुष्टि करने के लिए विश्लेषण के माध्यमिक तरीकों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
यह प्रोटोकॉल रिबोटैग मॉडल का उपयोग करके पुरुष चूहों की रोगाणु कोशिकाओं से राइबोसोम से जुड़े आरएनए के अलगाव का वर्णन करता है। माउस प्रजनन और नमूना संग्रह के लिए लेखांकन नहीं, प्रोटोकॉल दो दिन लगते हैं, तीन घंटे पहले दिन के साथ, सबसे अच्छा दोपहर में किया, एक रात ऊष्मायन, काम के पांच घंटे बाद सुबह के बाद । यह दृढ़ता से सिफारिश की जाती है कि स्टॉक समाधान (एचबी और एचएसडब्ल्यूबी) के साथ-साथ ऊतक पीसने की तैयारी पहले से की जाए। प्रोटोकॉल की समग्र सफलता सही genotyping और कड़ाई से RNase मुक्त शर्तों पर निर्भर है । विशिष्ट सेल प्रकारों के अनुवाद की जांच करने की क्षमता भविष्य के अध्ययनों को प्रतिलेखन, अनुवाद और असंख्य सेल प्रकारों और उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में प्रोटेम के बीच संबंधों को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति देगी।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को एनआईएच ग्रांट एनआईसीएचडी आर00एचडीआर083521 द्वारा ईएमएस और रटगर्स यूनिवर्सिटी से ईएमएस तक आंतरिक समर्थन के लिए वित्त पोषित किया गया था।
1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
Dissection scissors | Preference of researcher | ||
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
Heat block | Preference of researcher | ||
Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
NP-40 Alternative – CAS 9016-45-9 – Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |