Laserindusert hjerneskade i motorcortex av rotter

Summary

Protokollen som presenteres her viser en teknikk for å skape en gnagermodell av hjerneskade. Metoden som er beskrevet her bruker laserbestråling og retter seg mot motorcortex.

Abstract

En vanlig teknikk for å indusere slag i eksperimentelle gnagermodeller innebærer forbigående (ofte betegnet som MCAO-t) eller permanent (utpekt som MCAO-p) okklusjon av den midterste cerebrale arterien (MCA) ved hjelp av et kateter. Denne allment aksepterte teknikken har imidlertid noen begrensninger, og begrenser dermed utstrakt bruk. Stroke induksjon av denne metoden er ofte preget av høy variasjon i lokalisering og størrelse på iskemisk område, periodiske forekomster av blødning og høye dødelighet. Også vellykket gjennomføring av noen av de forbigående eller permanente prosedyrene krever kompetanse og varer ofte i ca 30 minutter. I denne protokollen presenteres en laserbestrålingsteknikk som kan tjene som en alternativ metode for å indusere og studere hjerneskade i gnagermodeller.

Sammenlignet med rotter i kontroll- og MCAO-gruppene viste hjerneskaden ved laserinduksjon redusert variasjon i kroppstemperatur, infarktvolum, hjerneødem, intrakraniell blødning og dødelighet. Videre forårsaket bruk av en laserindusert skade skade på hjernevevet bare i motorcortexen i motsetning til i MCAO-forsøkene der ødeleggelse av både motorcortex og striatal vev observeres.

Funn fra denne undersøkelsen tyder på at laser bestråling kan tjene som en alternativ og effektiv teknikk for å indusere hjerneskade i motorcortex. Metoden forkorter også tiden for å fullføre prosedyren og krever ikke ekspertbehandlere.

Introduction

Globalt er hjerneslag den nest ledende dødsårsaken og den tredje ledende årsaken til^{funksjonshemming 1}. Hjerneslag fører også til alvorlig funksjonshemning, ofte krever ekstra omsorg fra medisinsk personell og slektninger. Det er derfor et behov for å forstå komplikasjonene forbundet med lidelsen og forbedre potensialet for mer positive resultater.

Bruken av dyremodeller er det første skrittet for å forstå sykdommer. For å sikre de beste forskningsresultatene, vil en typisk modell inkludere en enkel teknikk, rimelighet, høy reproduserbarhet og minimal variasjon. Determinantene i iskemisk hjerneslag modeller inkluderer hjernen ødem volum, infarct størrelse, omfanget av blod-hjerne barriere (BBB) sammenbrudd, og funksjonell svekkelse generelt evaluert via nevrologisk alvorlighetsgrad score².

Den mest brukte slaginduksjonsteknikken i gnagermodeller okkluderer den midterste hjernearterien (MCA) forbigående eller permanent³. Denne teknikken produserer en slagmodell som ligner på de hos mennesker: den har en penumbra rundt strøkområdet, er svært reproduserbar, og regulerer iskemivarighet og reperfusjon⁴. Likevel har MCAO-metoden noen komplikasjoner. Teknikken er utsatt for intrakraniell blødning og skade på ipsilateral netthinnen med dysfunksjon av den visuelle cortex og vanlig hypertermi som ofte fører til ytterligere utfall^5,,6,,7. Andre begrensninger inkluderer store variasjoner i indusert slag (som følge av den sannsynlige forlengelsen av iskemi til utilsiktede regioner, som den eksterne halspulsåren), utilstrekkelig okklusjon av MCA og for tidlig reperfusjon. Også rotter av forskjellige stammer og størrelser viser ulike infarktvolumer⁸. I tillegg til alle ulempene nevnt, mcao modellen kan ikke indusere små isolerte slag i dype hjerneområder, fordi det er begrenset teknisk i forhold til kravet om minimum fartøystørrelse for kateterisering. Dette gjør behovet for en alternativ modell enda mer kritisk. En annen metode, fototrombose, gir et mulig alternativ til MCAO-prosedyrer, men forbedrer ikke effektiviteten⁹. Denne teknikken retter seg mot slag med lys og tilbyr noen forbedringer på de tidligere modellene. Fototrombose krever imidlertid en invasiv kraniotomi som er forbundet med sekundære kompications⁹.

I lys av skisserte mangler gir protokollen som presenteres her en dyktig alternativ laserteknikk for å indusere hjerneskade hos gnagere. Virkningsmekanismen til laserteknikken er basert på laserens fototermiske effekter formidlet på levende vev, noe som fører til absorpsjon av lysstråler av kroppsvev og deres konvertering til varme. Fordelene ved å bruke en laserteknikk er dens sikkerhet og enkel manipulasjon. En laser evne til å produsere varme for å stoppe blødning gjør det svært viktig i medisin, mens dens evne til å forsterke ulike bjelker på et gitt møtested sikrer at lasere unngå å ødelegge sunt vev som står i veien for målpunktet¹⁰. Laserstrålen som brukes i denne protokollen kan passere gjennom et lavt flytende medium, for eksempel bein, uten å slippe ut sin energi og / eller forårsake ødeleggelse. Når den når et høyt flytende medium, for eksempel hjernevev, bruker den opp sin energi til å ødelegge målvevet. Teknikken kan derfor indusere hjerneskade bare i riktig område av hjernen.

Teknikken som presenteres her viste en enorm mengde evne til å regulere nivåene av bestråling, og produserte de valgte variasjonene av hjerneskade beregnet fra starten. I motsetning til den opprinnelige MCAO som påvirker både cortex og striatum, laser teknikken var i stand til å regulere virkningen av hjerneskade, indusere skade bare på den tiltenkte motorcortex. Heri er den laserinduserte hjerneskadeprotokollen og et sammendrag av representative resultater for prosedyren som utføres på hjernebarken av rotter gitt.

Protocol

Følgende prosedyre ble utført i henhold til retningslinjene for bruk av eksperimentelle dyr i Det europeiske fellesskap. Eksperimentene ble også godkjent av Dyrevernskomiteen ved Ben-Gurion University of the Negev. 1. Valg og forberedelse av dyr Velg 65 hannSprague-Dawley rotter som veier 300 til 350 g uten overt patologi for denne prosedyren. Den mindre størrelsen utgjør tekniske problemer for MCAO-prosedyren. Tilordne 3 rotter per bur og la dem tilpasse seg i minst 3…

Representative Results

Ingen dødsfall eller SAH ble registrert i verken kontroll- eller eksperimentelle grupper (tabell 1). MCAO-gruppen hadde en 20 % rate av både dødelighet og SAH. De relative kroppstemperaturendringene i rotter i begge gruppene var også like, til tross for en forskjell i variasjonen i begge gruppene (tabell 1). Det var en betydelig verre NSS i både laseren (16 ± 1,1) og MCAO (20 ± 1,5) modeller, sammenlignet med den sham-operert…

Discussion

Det er rimelig å anta at laserteknikken er minimalt invasiv, gitt at ingen dødsfall eller SAH skjedde i lasergruppen. Den primære dødsårsaken og SAH er skade på blodkar som fører til en økning av intrakranielt trykk (ICP), som vist i de opprinnelige MCAO-teknikkene¹⁰. Fraværet av død og SAH i lasergruppen skyldes sannsynligvis de spesifikke effektene av lasere: de har ikke direkte innvirkning på blodårene og kan indusere koagulasjon i tilfelle lekkasje. Lavt infarktvolum og hjerneødem…

Materials

2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	SIGMA – ALDRICH	298-96-4
50% trichloroacetic acid	SIGMA – ALDRICH	76-03-9
Brain & Tissue Matrices	SIGMA – ALDRICH	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	1.83604E+11
Centrifuge Sigma 2-16P	SIGMA – ALDRICH	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	SIGMA – ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Digital Weighing Scale	SIGMA – ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA – ALDRICH	Z265969
Eppendorf pipette	SIGMA – ALDRICH	Z683884
Eppendorf Tube	SIGMA – ALDRICH	EP0030119460
Ethanol 96 %	ROMICAL		Flammable Liquid
Evans Blue 2%	SIGMA – ALDRICH	314-13-6
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	model Infinite 200 PRO multimode reader
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F
Petri dishes	SIGMA – ALDRICH	P5606
Scalpel blades 11	SIGMA – ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine	Laser Industries Ltd
Stereotaxic head holder	KOPF	900LS
Sterile Syringe 2 ml	Braun	4606027V
Syringe-needle 27 G	Braun	305620