Kovalent fastsättning av sondmolekyler till atomkraftsmikroskopi (AFM) cantilever tips är en viktig teknik för att undersöka deras fysiska egenskaper. Detta gör det möjligt för oss att bestämma stretching kraft, desorption kraft och längd polymerer via AFM-baserade enda molekyl kraft spektroskopi med hög reproducerbarhet.
Atomic force microscopy (AFM)-baserad enda molekyl kraft spektroskopi är ett idealiskt verktyg för att undersöka interaktioner mellan en enda polymer och ytor. För en sann enda molekyl experiment, kovalent fastsättning av sonden molekylen är viktigt eftersom först då kan hundratals kraft-förlängning spår med en och samma enda molekyl erhållas. Många spår är i sin tur nödvändiga för att bevisa att en enda molekyl ensam är sonderade. Dessutom är passivation avgörande för att förhindra oönskade interaktioner mellan den enda sondmolekylen och AFM-cantileverspetsen samt mellan AFM-kantileverspetsen och den underliggande ytan. Funktionsprotokollet som presenteras här är tillförlitligt och kan enkelt appliceras på en mängd olika polymerer. Karakteristiska enstaka molekylhändelser (dvs. sträckor och platåer) detekteras i kraftförlängningsspåren. Från dessa händelser kan fysiska parametrar som stretchingkraft, desorptionskraft och desorptionslängd erhållas. Detta är särskilt viktigt för den exakta undersökningen av stimuli-responsiva system på enmolekylnivå. Som exemplariska system poly(etenglykol) (PEG), poly( N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) och polystyren (PS) sträcks och desorbed från SiOx (för PEG och PNiPAM) och från hydrofoba självmonterade monoytor (för PS) i vattenmiljö.N
Sedan dess uppfinning på 1980-talet1, atomkraft mikroskop (AFM) har blivit en av de viktigaste bildteknikerna inom naturvetenskap med subnanometer rumslig upplösning, sub-piconewton kraftupplösning och möjligheten att mäta i olika lösningsmedel och temperaturförhållanden2,3,44,5,6,7.
Förutom bildframställning8,9, används AFM för att utföra enmolekylkraftspektroskopi (SMFS) som ger insikt i självhäftande interaktioner mellan en enda polymer och ytor, fysiska egenskaper hos enskilda polymerer och utfällningsmekanismer för proteiner7,,10,,11,12,13,1414,15,16. I ett vanligt SMFS-experiment kommer den funktionäriserade cantileverspetsen i kontakt med en yta så att polymeren vid AFM-cantileverspetsen physisorbs till denna yta. Genom att dra tillbaka AFM-cantileverspetsen från ytan omvandlas en ändring av avböjningen av AFM-cantilever till en kraft som leder till en kraftförlängningskurva4. Fysiska parametrar såsom sträckkraft, desorptionskraft och desorptionslängd kan bestämmas beroende på olika parametrar såsom draghastighet, uppehållstid på ytan, indragsdjup i ytan, temperatur, lösningsmedel17,,18 och olika ytor som substrat, polymerfilmer eller stödda lipidbilayers19,20,,21,22. Dessutom kan en polymer undersökas i olika rumsliga riktningar, vilket undersöker friktionsegenskaperna hos polymeren23,24,25,26.
En kovalent fastsättning av den undersökta polymeren till en AFM-kantileverspets är nödvändig för sådana studier. Således förhindrar en hög avkastning av enstaka molekyl händelser med en och samma polymer bunden till en AFM cantilever spets någon bias av resultaten på grund av kalibrering av fjäderkonstanten av AFM cantilever27,28, varierande fästpunkter29 eller varierande polymerer (med olika konturer längder) såsom i fallet med nanofiske experiment30,31,32. Också, interaktioner med andra polymerer samt i genomsnitt effekter kan allmänt förebyggas18,28. För kovalent fastsättning av en polymer till AFM cantilever spets, olika typer av kemiska modifieringar kan tillämpas, varav många sammanfattas i boken av Hermanson33. Amin och thiol-baserade länka reaktioner samt klicka kemi representerar de vanligaste metoderna i AFM cantilever spets funktionalisering34,35,36,37,38,39,40,41,42.36 Becke et al.40 visar hur man använder 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC)/NHS kemi för att fästa ett protein på en AFM-cantilever spets. Men dessa funktionella grupper tenderar att crosslink, vilket leder till en förlust av funktionalitet43,44. Dessutom visar karbodiimider en tendens att snabb hydrolys i lösning43. Maleimide och thiol grupper är i allmänhet mer stabila och visar inte crosslinking reaktioner. Det presenterade protokollet är en optimering av de tidigare publicerade protokollen som anges i referenserna35,39.
Här presenteras ett tillförlitligt funktionaliseringsprotokoll som enkelt kan anpassas till ett stort antal olika polymerer, oavsett egenskaper som konturlängd eller hydroforbicitet. Tre olika polymerer valdes som exempel: hydrofil polyetenglykol (PEG)Noch poly( N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) samt hög mola massa hydrofoba polystyren (PS). För att ge en kovalent bindningsförmåga med en lämplig länkningsmolekyl valdes de tre polymererna ut för att ha en telechelic thiol moiety som funktionell slutgrupp. Länkermolekylen i sig är vanligtvis en kort PEG-polymer med två aktiva platser, en silanegrupp i ena änden och en maleimidegrupp i andra änden. Den förstnämnda möjliggör en kovalent fastsättning till AFM-kantileverspetsen och den senare en bindande reaktion med tiagruppen av den funktionella masspolymeren med hög molar. Dessutom fungerar inaktiva PEG-länkarmolekyler som ett passivationsskikt för att förhindra oönskade interaktioner mellan sondpolymeren och AFM-cantileverspetsen samt mellan AFM-kantileverspetsen och den underliggande ytan.
AFM-baserade SMFS är ett av de viktigaste verktygen för att undersöka interaktioner med enmolekyler inom polymerfysik. För en sann enda molekyl experiment, kovalent fastsättning av sonden polymer till en AFM cantilever spets är viktigt.
Många tidigare verk är baserade på nanofiske experiment, särskilt för PNiPAM, där polymerer adsorberas på en yta och sedan sträcks genom att slumpmässigt plocka dem från substratet med hjälp av en AFM cantilever spets30,31. Detta kan förändra resultaten och leda till feltolkning av den enda molekylen beteende. Där kan kooperativa effekter dominera resultaten eftersom interaktioner med angränsande polymerer inte kan uteslutas. Detta har en stor inverkan på resultaten, särskilt för polymerer som visar betydligt annorlunda beteende i bulk jämfört med enstaka isolerade molekyler57,58.
Funktionsprotokollet som presenteras här är tillförlitligt och kan enkelt appliceras på olika polymerer, oavsett deras konturlängd, hydroforbicitet eller monomerernas sterichinder. Dessutom tillhandahålls en passivation för att förhindra oönskade interaktioner mellan den enda sondpolymeren och AFM-kantileverspetsen samt mellan AFM-kantileverspetsen och den underliggande ytan. Dessutom visas utvärderingen av force-extension-kurvor som visar stretchinghändelser. Där föreslås ett förfarande för bestämning av huvudkraftförlängningskurvor. Detta ger ett bättre sätt att avslöja, t.ex. Dessutom tillhandahålls analys av enstaka molekyldesorptionhändelser med konstanta kraftplatåer. Dessutom ges ett enkelt sätt att korrigera sinusoidala kraftsignalartefakter i kraft-förlängningskurvor som annars kan försämra experimentets resultat.
Jämfört med Stetter et al.39reduceras det funktionaliseringsförfarande som presenteras här till tre steg i stället för fyra och procedurens robusthet förbättras. Den stora fördelen med att utföra PEGylation och silanisering i ett steg är att få en bättre kontrollerad reaktion och att öka avkastningen. Dessutom behöver färre lösningar förberedas och färre sköljsteg krävs. Detta minskar ansträngningen och tiden för beredning och ökar reproducerbarheten. Dessutom är flytta AFM cantilevers alltid en viktig del av funktionaliseringsprocessen. En överföring från en lösning till den andra riskerar alltid att starkt påverka funktionaliseringskvaliteten på grund av överföringar via luftvattengränssnittet eller att förlora AFM-cantilevers genom felaktig användning av pincett.
För att bevisa korrekt kovalent fastsättning av en enda polymer till en AFM-kantileverspets måste olika villkor uppfyllas. För det första är kontroll AFM-kantileverav av stor betydelse och bör förberedas för varje funktionalisering. Funktionaliseringsprocessen och vätskecellen för att utföra experimenten anses endast vara rena, om ett litet antal kraftförlängningskurvor visar sträckor eller platåer i kontrollexperimentet (i de presenterade exemplen mindre än 2 %).
Ett tydligt stretchingmönster utan ytterligare droppar eller maxima är viktigt för att ha rätt enda molekyl stretching händelser. Dessutom bör beroendet av bristningkraft på kraftbelastningshastigheten vid bristning eller det fullständiga elastiska svaret från sträckningskurvan analyseras för att utesluta samtidig desorption av flera polymerer59,60. För PEG och PNiPAM visade 19% och 42% av kraftförlängningskurvorna som togs på olika positioner på ytan ett sådant stretchingmönster. För att få stretching händelser, physisorption av polymeren till respektive underliggande yta måste vara stark. Annars observeras en platåliknande desorptionhändelse. Detta är ännu mer avgörande för att upptäcka stretching händelser vid höga krafter (upp till 500 pN eller mer). Eftersom denna starka fysisorption inte uppfylls för varje kraft-förlängning kurva, avkastningen av sådana händelser är mindre än för ren platå-liknande desorption händelser. Som ett alternativ kan starkt hålla grupper som katekol eller chemisorption mellan polymer och underliggande yta användas. Detta kräver dock att ytterligare funktionella grupper eller kopplingsplatser införs vid polymeren61,,62.
Polymerens massa (dvs. konturlängd) ger ett värdefullt fingeravtryck. Även om massan inte direkt kan översättas till den uppmätta konturlängden av följande skäl, är längdfördelningen mycket värdefull för att definiera händelser med en molekyl. När det gäller en PNiPAM-polymer med låg polydispersity (中= 1,28) fann vi betydande skillnader i förlängningsvärdena för de erhållna stretchinghändelserna (och därmed i polymerlängden) i experimenten. En anledning till detta kan vara bestämningen av polymerlängden och dess fördelning. I storlek-uteslutning kromatografi (SEK), en relativ vikt av målet polymerbestäms i jämförelse med standarder som PS eller poly (metyl metakrylat) (PMMA)63. Den förmodade relativa vikten förväntas avvika från den absoluta molekylvikten eftersom målpolymerens hydrodynamiska radie och standarden kan skilja sig avsevärt. Dessutom kan silane skiktet oligomerized av falska vatten i toluen under funktionaliseringsprocessen. Fastsättningen av sådana oligomers till AFM-kantileverspetsen leder till ett mer flexibelt lager med färre ankarpunkter64. Polymerens fästpunkt till silikonskiktet kanske inte nödvändigtvis ligger i spetsen som leder till en förskjutning av de upptäckta längdvärdena29. Medan en polymermodell som maskliknande kedja (WLC) eller den fritt ledade kedjan (FJC) modellen inte kan återge respektive force-extension beteende för PEG eller PNiPAM ordentligt över hela förlängningsområdet18,29,4141,65,66, en sådan polymer modell kan vara värdefullt för andra polymera och proteinsystem10,15,,67,68.
Kovalent fastsättning av en enda PS-polymer (med en konturlängd på mer än 1 μm) anses endast vara framgångsrik, när ett stort antal kraftförlängningskurvor visar en tillräckligt lång platå med konstant kraft (figur 5). En platå som härrör från desorbing en enda polymer definieras av en enda skarp droppe av en konstant kraft till baslinjen vid en viss förlängning, som anges i figur 5A. Om fler polymerer är fästa vid AFM-kantileverspetsen observeras en kaskad av platåer56 (figur 5C). Platånlängd (desorptionslängd), korrelerad med polymerkonturlängden51, måste vara betydligt längre än någon vidhäftningstopp på grund av ospecifik vidhäftning av AFM-cantileverspetsen till den underliggande ytan (här omkring 200 nm). Funktioner som endast visas i en enda kraftförlängningskurva bör inte tolkas. I de presenterade experimenten visade minst 80 av 100 kurvor en platå längre än 200 nm i minst två kraftkartor på två olika platser på ytan. Dessutom visar fördelningen av desorptionslängder, med hjälp av spridningsområden som anges i figur 5B och 5D,om och hur många polymerer som är bundna till AFM-kantileverspetsen. När det gäller PS fungerade en smal fördelning av desorptionskraft och längd som tagits från platåer i kraftförlängningskurvorna som bevis på ett framgångsrikt kovalent fastsättning. Detta bevisade slutligen framgången av functionalizationprotokollet. Därför rekommenderar vi starkt att presentera sådana kraft- och längdfördelningar i publikationer.
Utvärdering av kraftförlängningskurvor med inbyggda algoritmer som utgör många förinställda parametrar bör göras varsamt. Skäl en fast provtagningshastighet är till exempel inte lämplig för varje tillämpad draghastighet eller att en automatisk utjämning av kraftförlängningskurvorna kan vara i genomsnitt viktiga detaljer. Vanligtvis en korrekt förståelse av respektive utvärderingsförfarande kan förhindra fel i utvärderingsförfarandet, som i sin tur starkt kan påverka de slutliga resultaten av en AFM-baserade SMFS experiment.
Sammanfattningsvis presenterar vi ett funktionsiseringsprotokoll som är tillförlitligt och lätt kan appliceras på en mängd olika polymerer. Dessutom presenteras en korrekt utvärdering av enmolekylkraftförlängningskurvor, vilket gör det möjligt att bestämma fysiska parametrar som sträckkraft, desorptionskraft och desorptionslängd. De presenterade protokollen och procedurerna är värdefulla för undersökning av stimuli-responsiva system på enmolekylnivå.
The authors have nothing to disclose.
B.N.B. och T.H. erkänner finansiering från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen) inom ramen för Tysklands spetsforskningsstrategi – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, och bevilja HU 997/1-13 (projekt # 420798410). M.G. erkänner delvis stöd inom ramen för LOEWE-projektet iNAPO av Hessenstate Ministry of Higher Education, Research and the Arts. Vi tackar Dr Wolfgang Bronner och Dr Agne Zukauskaite från Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF för donation av högkvalitativa guldbelagda kisel rån.
1-Dodecanethiol (≥98%) | Sigma-Aldrich, USA | 417364-500ML | Used for SAM |
Ammonia solution (30%) | Roth, Germany | CP17.2 | Used for cleaning |
Cypher ES | Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA | – | AFM |
Ethanol (≥99.9%) | Roth, Germany | PO76.1 | Solvent |
Gold coated silicon wafer | Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany | – | Used for SAM |
High Resolution Replicating Compound | Microset Products Ltd, UK | 101RF | Bonding agent |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | Used for cleaning |
Igor Pro | Wavemetrics, USA | – | Software environment |
Tetra-30-LF-PC | Diener Electronic, Germany | – | Plasma chamber |
Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane | Creative PEG works, USA | PHB-1923 | Linker polymer |
MLCT-Bio-DC | Bruker, USA | MLCT-Bio-DC | AFM cantilever |
Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV < 10 µm | MicroChemicals, Germany | WSA40600250 P1314SNN1 | Silicon wafer |
Purelab Chorus 1, 18.2 MΩ cm | Elga LabWater, Germany | 10034-540 | Ultrapure water source |
R3 SA | Vomm GmbH, Germany | 5803 Blank | Tweezers |
Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide) | Gallei Group, Saarland University, Germany | – | PNiPAM probe polymer |
Thiol terminated polystyrene | Polymer Source, Canada | P40722-SSH | PS probe polymer |
Thiol-polyethylene glycol-thiol | Creative PEGWorks, USA | PSB-615 | PEG probe polymer |
Toluene (99.99%) | Fisher Chemicals | T324-500 | Solvent |