Ici nous décrivons un protocole pour l’imagerie cellulaire vivante du cytosquelette cortical de microtubule au meristem apical de pousse et surveillant sa réponse aux changements des forces physiques.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Imagerie cellulaire en direct du cytosquelette microtubule et manipulation micromécanique de l’Arabidopsis Shoot Apical Meristem
Dans cet article
Résumé
Résumé
La compréhension de la régulation de la croissance et de la morphogenèse au niveau des cellules et des tissus est à l’avant-garde de la recherche biologique depuis de nombreuses décennies. Les progrès des technologies moléculaires et d’imagerie nous ont permis d’avoir un aperçu de la façon dont les signaux biochimiques influencent les événements morphogenétiques. Cependant, il est de plus en plus évident qu’en dehors des signaux biochimiques, les signaux mécaniques ont également un impact sur plusieurs aspects de la croissance cellulaire et tissulaire. L’Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) est une structure en forme de dôme responsable de la génération de tous les organes en surface. L’organisation du cytosquelette cortical de microtubule qui médie le dépôt apoplastique de cellulose dans les cellules végétales est spatialement distincte. La visualisation et l’évaluation quantitative des modèles des microtubules corticals sont nécessaires pour comprendre la nature biophysique des cellules au SAM, car la cellulose est la composante la plus rigide de la paroi cellulaire végétale. La forme stéréotypée de l’organisation corticale de microtubule est également une conséquence des forces physiques tissulaires existant au SAM. La perturbation de ces forces physiques et la surveillance subséquente de l’organisation corticale de microtubule permettent l’identification des protéines candidates impliquées dans la médiation de la méchano-perception et de la transduction. Ici, nous décrivons un protocole qui aide à étudier de tels processus.
Introduction
Les cellules végétales sont entourées d’une matrice extracellulaire de polysaccharides et de glycoprotéines qui ressemble mécaniquement à un matériau composite renforcé de fibre capable de modifier dynamiquement ses propriétésmécaniques 1. La croissance des cellules végétales est entraînée par l’absorption d’eau dans la cellule, ce qui entraîne une accumulation concomitante de forces tensiles sur la paroi cellulaire. En réponse à ces forces, les modifications apportées à l’état physique de la paroi cellulaire permettent l’expansion cellulaire. Les cellules dont les parois primaires sont capables de subir une croissance rapide par rapport à la p....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Croissance des plantes
- Semer les graines d’Arabidopsis exprimant le domaine de liaison microtubule fusionné avec la protéine fluorescente verte (MBD-GFP)10 sur le sol et se maintenir en longue journée (16 h jour /8 h nuit), 20 °C/6 °C conditions pendant 1 semaine pour la germination.
- Après la germination, transférer les semis vers de nouveaux pots avec suffisamment d’espace de croissance pour permettre une croissance végétative robuste. Gardez les plantes en court jour (8 h jour /16 h nuit), 20 °C/16 °C pendant 3-5 semaines.
- Transférer les plantes à une longue journée (16 h le jour /8 h la nuit), 20 °C/....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
La figure 1 montre des images de projection typiques obtenues à partir de lignes MBD-GFP avec des cellules au centre du dôme contenant des microtubules corticals désorganisés, et des cellules à la périphérie ayant une distribution circonférentielle (figure 1A,B), tandis que les cellules du domaine limite contiennent des microtubules corticals alignés parallèlement au long axe de la cellule. Ces observations montr.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
L’évaluation des événements de transduction du signal mécanique est cruciale pour identifier les régulateurs moléculaires impliqués dans les voies de mécano-perception et de transduction. Le protocole décrit ici fournit une vue quantitative de tels événements en utilisant la réponse corticale de microtubule comme lecture pour un tel processus dans arabidopsis SAMs. La procédure décrite ici est couramment utilisée dans plusieurs études dans divers types de tissus16,
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 microscope confocal | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| microporeuse | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Méthodes Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladénine | Sigma | B3408 | |
| acide nicotinique | Sigma | N4126 | |
| boîte à charnière en plastique | Microscopie électronique | sciences 64312 | |
| PPM (Plant Preservation Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Iodure de propidium | Sigma | P4864 | |
| chlorhydrate de pyridoxine | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| chlorhydrate de thiamine | Sigma | T4625 |
Références
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
