단일 DNA 분자에서 대규모 병렬 단백질 합성을 위한 펨토리터 물방울 배열
Summary
프로토콜의 전반적인 목표는 세포 없는 단백질 합성에 사용될 수 있는 1cm2 평면 기판에 1백만 개 이상의 주문, 균일, 안정 및 생체 호환 펨토리터 물방울을 준비하는 것입니다.
Abstract
과학 계측의 공간 해상도 및 검출 감도의 발전으로 생물학적 및 화학 연구에 작은 원자로를 적용할 수 있습니다. 고성능 마이크로반응기의 수요를 충족하기 위해 펨토리터 액적 어레이(FemDA) 장치를 개발하고 대규모 병렬 세포 없는 단백질 합성(CFPS) 반응에서 적용을 예시했습니다. 2단계 오일 밀봉 프로토콜을 사용하여 손가락 크기의 영역 내에서 100만 개 이상의 균일한 물방울이 쉽게 생성되었습니다. 모든 액적은 친수성 바닥과 소수성 측벽으로 구성된 펨토리터 마이크로 챔버에 고정되었습니다. 하이브리드 소수성 소수성 구조와 전용 밀봉 오일 및 계면 활성제는 증발 손실없이 펨토리터 공간에서 펨토리터 수성 용액을 안정적으로 유지하는 데 매우 중요합니다. 펨토리터 구성과 FemDA 장치의 간단한 구조는 최소한의 시약 소비를 허용했습니다. 액적 반응기의 균일한 치수는 대규모 정량적 및 시간 과정 측정을 설득력 있고 신뢰할 수 있게 만들었습니다. FemDA 기술은 각 물방울에 있는 DNA 분자의 수와 CFPS 반응의 단백질 수율을 상관시합니다. 우리는 장치의 미세 제조, 펨토리터 방울의 형성, 현미경 이미지 데이터의 수집 및 분석에 대한 절차를 간소화했습니다. 최적화된 낮은 운영 비용을 갖춘 상세한 프로토콜은 표준 클린룸 시설과 기존의 형광 현미경을 갖춘 모든 사람이 FemDA 기술을 이용할 수 있게 합니다.
Introduction
연구원은 바이오/화학 반응을 수행하기 위해 반응기를 사용합니다. 원자로의 크기를 줄이고 시약 소비를 낮추면서 작업 효율을 높이기 위해 실험 처리량을 늘리기 위한 상당한 노력이 이루어지고 있습니다. 두 측면 모두 연구원들을 무거운 작업부하에서 해방시키고 비용을 절감하며 연구 개발 속도를 높이는 것을 목표로 합니다. 우리는 반응 량과 처리량의 관점에서 원자로 기술의 개발에 대한 명확한 역사적 로드맵을 가지고 : 단일 비커 / 플라스크 / 테스트 튜브, 밀리리터 튜브, 마이크로리터 튜브, 마이크로리터 8튜브 스트립, 마이크로리터 96/384/1536웰 플레이트, 미세유체 나노리터/피콜리터/펨톨리터 반응기1,,2,,3,,4,,5,6,7.,7 지난 수십 년 동안 반도체 산업의 집적 회로 칩에 트랜지스터의 특징 크기를 축소하는 유사, 바이오 / 화학 마이크로 반응기는 볼륨 감소 및 시스템 통합을 겪고있다. 이러한 소규모 도구는 세포 기반 또는 세포가 없는 합성 생물학, 바이오 제조 및 고처리량 프로토타이핑 및 스크리닝8,9,9,10,,11,,12에지대한 영향을 미쳤다. 이 논문은 독특한 물방울 어레이 기술 개발에 대한 최근의 노력을 설명하고 합성 생물학 및 분자 선별 커뮤니티14의기본 기술인 CFPS13에서의 적용을 보여줍니다. 특히, 우리는 의도적으로 모든 사람이 FemDA 장치에 액세스 할 수 있도록 최적화된 저비용 프로토콜을 제공합니다. 소형 화된 장치에 대한 저렴한 비용과 취급하기 쉬운 프로토콜은 대학의 교육 목적에 기여하고 기술을 전파하는 데 도움이 될 것입니다.
FemDA는 평면 유리 기판에 1cm2 당 106의 초고밀도에서 펨토리터 방울을 준비합니다. 우리는 기판상에 마이크로 챔버 어레이를 생성하기 위해 미리 정의된 위치에서 유리 기판에 소수성 폴리머, CYTOP15를코팅하고 선택적으로 에칭 (제거) CYTOP. 따라서, 생성된 마이크로챔버는 소수성 측벽(CYTOP) 및 친성 바닥(glass)으로 구성된다. 패턴 표면 위로 물과 기름이 순차적으로 흐르면 물을 밀고 마이크로 챔버로 밀봉 할 수 있습니다. 소수성 소수성 구조는 마이크로 챔버 외부의 물을 격퇴하고, 개별 미세 반응기를 격리하고, 펨톨리터 공간 내부에 작은 수성 용액을 유지하는 데 필수적입니다. 독특한 성질은 수유 물방울과 지질 이중층 마이크로컴파트먼트16,,17의제조를 성공적으로 위해 적용되었다. 프로토타입장치(16)에비해, 먼저 CYTOP 폴리머의 완전한 제거뿐만 아니라 유리 바닥의 완전한 노출을 실현하기 위해 미세 제조 공정을 최적화했습니다. CYTOP은 유리, 플라스틱 및 실리콘과 같은 기존 미세 반응기 재료보다 표면 장력 (19 mN /m)보다 낮은 특수 불소 폴리머입니다. 그것의 좋은 광학, 전기 및 화학 적 성능은 이미 미세 유체 장치(18,19,,20,,21,22, 22,,,,23,,24)의표면 처리에 활용되었다. FemDA 시스템에서는 CYTOP 표면에서 오일의 좋은 습윤을 달성하기 위해 오일의 표면 장력은 고체표면(25)보다낮아야 한다. 그렇지 않으면, 고체 표면과 접촉하는 액체 오일은 표면 위로 퍼지기보다는 구형이 되는 경향이 있다. 게다가, 우리는 몇몇 대중적인 퍼플루오로카본 오일 (예를 들면, 3M FC-40)16 및 하이드로 플루오로에테르 오일 (예를 들면, 3M Novec 시리즈)는 정량측정에 치명적이고 방울 중 교차 오염의 관점에서 의심할 것이다 CYTOP의 비정질 형태결과로 CYTOP를 용해할 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 다행히도, 우리는 낮은 (&19 mN/m) 표면 장력13을전시하는 생체 적합성 및 환경 친화적 인 오일을 확인했습니다. 또한 선택된 오일및 기능에 용해할 수 있는 새로운 계면활성제를 보다 낮은 농도(0.1%, 적어도 10배 이상 낮은 것으로 보고된 인기 대상자26,,27)13을발견했다. 그 결과 물/오일 인터페이스는 계면활성제에 의해 안정화될 수 있다. 오일의 높은 증발 속도 때문에, 오일플러시에 이어, 우리는 마이크로 챔버를 밀봉하는 첫 번째 오일을 대체하기 위해 또 다른 생체 적합성 및 환경 친화적 인 오일을 적용했다. 우리는 첫 번째 오일 (ASAHIKLIN AE-3000 와 0.1 wt % SURFLON S-386) “플러시 오일”과 두 번째 오일 (Fomblin Y25)을 각각 “밀봉 오일”이라고 부릅니다.
2단계 오일 밀봉 전략은 정교한 계측 없이 몇 분 안에 펨토리터 액적 배열의 견고한 형성을 실현할 수 있습니다. 증발 문제로 인해 피콜리터부피(28)보다작은 미세 반응기를 생성하는 것이 어려운 것으로 간주되고 있다. FemDA는 미세 반응기/물방울 의 제조에 사용되는 재료와 공정을 체계적으로 최적화하여 이 문제를 해결했습니다. 결과 물방울의 몇 가지 주목할 만한 특징은 높은 균일성 (또는 단백성), 안정성 및 펨토리터 척도에서 생체 적합성을 포함한다. 액적 볼륨의 변형 계수(CV)는 3%에 불과하며(미세한 이미지에 대한 비네팅 보정 없이), 세계에서 가장 작은 CV로, 이는 매우 병렬 및 정량적 측정을 보장합니다. 펨토리터 액적은 실온의 방울 중 교차 오염 없이 최소 24시간 동안 안정적이며, 이는 신뢰할 수 있는 타임코스 측정에 유용합니다. 생체 적합성에 관해서는, 이전에 어렵거나비효율적인,것으로 여겨졌던 펨토리터 액적물에서 단일 복사 템플릿 DNA로부터 다양한 단백질을 합성하는 데성공했다. 왜 FemDA에서 합성 될 수 있는 몇몇 단백질이 그밖 물방울 시스템에서 합성될 수 없는지 해명할 가치가 있을 것입니다. FemDA는 단순히 기술적 진보가 아니라 단백질 수율(액적의 형광 강도에 의해 반영되는)을 각 액적의 템플릿 DNA 분자 수와 연관시킬 수 있는 전례 없는 정량적 측정을 실현했습니다. 그 결과, FemDA 기반 CFPS의 형벌 강도의 히스토그램은 동일한 피크-투-피크 간격의 가우시안 분포의 합계에 의해 멋지게 장착될 수 있는 이산 분포를 보였다. 더욱이, DNA 분자의 상이한 수를 포함하는 물방울의 발생 확률은 푸아송분포(31)에딱 맞다. 따라서, 각 액적에서 상이한 단백질 수율은 이산 분포에 기초하여 정규화될 수 있다. 이 중요한 기능을 사용하면 효소 활동 정보를 다른 미세 반응기 플랫폼과 함께 사용할 수 없었던 명백한 강도와 분리할 수 있습니다. 기존 미세 유체 세포/물방울 선별 시스템은 완전 자동 정렬에 능숙하며 시료 집중에 능숙하지만 때로는 분석 양면32,,33에서비교적 광범위하거나 긴 꼬리 히스토그램만 출력할 수 있습니다. 당사의 고정정성 및 생체 적합성 FemDA 시스템은 미세 반응기 개발 분야에서 새로운 벤치마크와 높은 분석 표준을 설정합니다.
물방울의 제조에 사용할 수있는 오일과 계면 활성제는 여전히 매우 제한되어있습니다 34. FemDA에 설립된 ASAHIKLIN AE-3000과 SURFLON S-386의 조합은 수성 상과 오일 상13단계사이의 물리화학 적 인터페이스의 성장 무기고의 새로운 멤버이다. FemDA의 새로운 인터페이스는 물리적으로 안정적이고 화학적으로 불활성이며, 많은 종류의 단백질을 위한 복잡한 전사, 번역 및 번역 후 수정 기계와 생물학적으로 호환된다13. 대신 액적 설정에서 합성 할 수없는 단백질을 찾는 것이 오히려 매력적일 것입니다. 게다가, 시약의 비용 절감은 나노 리터 및 피콜리터 원자로 시스템35,,36보다펨톨리터 액적 시스템에서 더 분명하다. 특히, 주로 튜브 또는 외부 공급에 의해 발생 되는 큰 죽은 볼륨이 있을 것 이다, 미세 유체 방울 생성 시스템에 하지만 우리의 FemDA에. 어레이 형식은 빠르게 움직이는 오브젝트에 대한 단일 스냅숏이 아니라 모든 단일반응기(37)에대해 반복적이고 상세한 현미경 특성화(소위 고함량 분석과 유사)에 의해 선호됩니다. 펨토리터 스케일은 손가락 크기의 영역에 100만 개 이상의 원자로를 통합할 수 있었으며, 동일한 수의 나노리터 원자로(존재하는 경우)는 평방 미터 면적에 필요하며, 이는 의심할 여지 없이 이러한 시스템을 제조하거나 사용하는 것이 비실용적일 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
FemDA의 매우 균일하고 안정적이며 생체 적합성을 기반으로 한 고정량 측정은 다른 연구와 는 다른 독특한 특징인 이산 분포를 가능하게 했습니다. 우리는 체계적으로 최적화하고이 논문에서 미세 제조 및 액적 형성 과정을 자세히 설명했다. 설정된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
첫째, 직사각형 얇은 유리 기판상의 고점성 CYTOP 폴리머의 균일한 코팅은 크게 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 JSPS KAKENHI 교부금 번호 JP18K14260및 해양-지구 과학 기술에 대한 일본 기관의 예산에 의해 지원되었다. 특성화 시설을 제공해 주신 데구치 시게루(JAMSTEC)와 이쿠타 테츠로(JAMSTEC)에게 감사드립니다. 상용 소프트웨어 지원에 대한 다카이 켄(JAMSTEC)에 감사드립니다. 마이크로패브릭은 도쿄대학교 다케다 센탄치 슈퍼클린룸에서 실시되었으며, 일본 교육문화체육관과학부(MEXT)의 ‘나노기술 플랫폼 프로그램’, 일본 보조금 번호 JPMXP09F19UT00087이 지원되었다.
Materials
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| 2-propanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. |
| 3D laser scanning confocal microscope | Lasertec | OPTELICS HYBRID | Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable. |
| 50 mL syringe | Terumo | SS-50LZ | |
| 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate | Thermo Fisher Scientific | D6567 | Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide |
| Acetone | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.8%. |
| Air blower | Hozan | Z-263 | |
| Aluminum block | BIO-BIK | AB-24M-02 | |
| Aluminum microtube stand | BIO-BIK | AB-136C | |
| ASAHIKLIN AE-3000 | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| BEMCOT PS-2 wiper | Ozu | 028208 | |
| Biopsy punch with plunger | Kai | BPP-10F | |
| Cover glass | Matsunami Glass | No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) | Size-customized. |
| Cover glass staining rack | Nakayama | 803-131-11 | |
| CRECIA TechnoWipe clean wiper | Nippon Paper Crecia | C100-M | |
| Cutting mat | GE Healthcare | WB100020 | |
| CYTOP | AGC | CTL-816AP | |
| Deaeration mixer | Thinky | AR-100 | |
| Desktop cutter | Roland | STIKA SV-8 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 300 MIF | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.) |
| Double-coated adhesive Kapton film tape | Teraoka Seisakusho | 7602 #25 | |
| Ethanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.5%. |
| Fiji | Version: ImageJ 1.51n | ||
| Flat-cable cutter | Tokyo-IDEAL | MT-0100 | |
| Fomblin oil | Solvay | Y25, or Y25/6 | Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available. |
| Hot plate | AS ONE | TH-900 | |
| Injection needle | Terumo | NN-2270C | 22G × 70 mm |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required. |
| KaleidaGraph | Synergy | Version: 4.5 | |
| Mask aligner | SUSS | MA-6 | Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable. |
| MICROMAN pipette | GILSON | E M250E | Capillary piston tip: CP250 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Version: 16.16.15 | |
| Mini vacuum chamber | AS ONE | MVP-100MV | |
| Nuclease-free water | NIPPON GENE | 316-90101 | |
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PCR tube | NIPPON Genetics | FG-021D/SP | |
| Petri dish | AS ONE | GD90-15 | Diameter 90 mm, height 15 mm. |
| Photoresist | AZ Electronic Materials | AZ P4903 | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative. |
| Plate reader | BioTek | POWERSCAN HT | |
| Polyethelene gloves | AS ONE | 6-896-02 | Trade name: Saniment. |
| PURExpress in vitro protein synthesis kit | New England Biolabs | E6800S or E6800L | For cell-free protein synthesis reaction. |
| Reactive-ion etching system | Samco | RIE-10NR | Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.) |
| RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | |
| Scotch tape | 3M | 810-1-18D | |
| Sodium hydroxide solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-09575 | 8 M concentration; danger. |
| Spin coater | Oshigane | SC-308 | |
| SURFLON S-386 surfactant | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| SYLGARD 184 silicone elastomer | Dow | Sylgard184 | Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m). |
| Tweezers | Ideal-tek | 2WF.SA.1 2A |
|
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | ASU-2M | |
| Vacuum chuck | Oshigane | (Customized) | Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm). |
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