एकल डीएनए अणुओं से बड़े पैमाने पर समानांतर प्रोटीन संश्लेषण के लिए एक फेमोलीटर ड्रॉपलेट सरणी
Summary
प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य 1 सेमी2 प्लैनर सब्सट्रेट पर 1 मिलियन से अधिक ऑर्डर किए गए, समान, स्थिर और बायोस्पांथीय फेमेटोलिएटर बूंदों को तैयार करना है जिसका उपयोग सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
Abstract
स्थानिक संकल्प में प्रगति और वैज्ञानिक उपकरणों की संवेदनशीलता का पता लगाने से जैविक और रासायनिक अनुसंधान के लिए छोटे रिएक्टरों को लागू करना संभव हो जाता है । उच्च प्रदर्शन वाले माइक्रोरिएक्टरों की मांग को पूरा करने के लिए, हमने एक फेमटोलिएटर ड्रॉपलेट सरणी (फेमडीए) डिवाइस विकसित किया और बड़े पैमाने पर समानांतर सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) प्रतिक्रियाओं में इसके आवेदन का उदाहरण दिया। दो कदम तेल-सीलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके उंगली के आकार के क्षेत्र के भीतर १,०००,००० से अधिक वर्दी की बूंदों को आसानी से उत्पन्न किया गया था । हर बूंद एक हाइड्रोफिलिक नीचे और एक हाइड्रोफोबिक साइडवॉल से बना एक फेमटोलिएटर माइक्रोचैंबर में लंगर डाले हुए था । हाइब्रिड हाइड्रोफिलिक-इन-हाइड्रोफोबिक संरचना और समर्पित सीलिंग तेल और सर्फेक्टेंट वाष्पीकरण हानि के बिना फेमोलीटर अंतरिक्ष में फेमोलीटर जलीय समाधान को स्थिर रूप से बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। फेमडा डिवाइस की फेमोलीटर कॉन्फ़िगरेशन और सरल संरचना ने न्यूनतम अभिकर्मक खपत की अनुमति दी। बूंद रिएक्टरों के एक समान आयाम बड़े पैमाने पर मात्रात्मक और समय पाठ्यक्रम माप कायल और विश्वसनीय बना दिया । फेमडीए प्रौद्योगिकी प्रत्येक बूंद में डीएनए अणुओं की संख्या के साथ CFPS प्रतिक्रिया के प्रोटीन उपज सहसंबद्ध । हमने डिवाइस के माइक्रोफैब्रिकेशन, फेमोलीटर बूंदों के गठन और सूक्ष्म छवि डेटा के अधिग्रहण और विश्लेषण के बारे में प्रक्रियाओं को सुव्यवस्थित किया। अनुकूलित कम रनिंग लागत के साथ विस्तृत प्रोटोकॉल फेमडीए तकनीक को हर किसी के लिए सुलभ बनाता है, जिसके पास मानक क्लीनरूम सुविधाएं और अपनी जगह पर एक पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप है।
Introduction
शोधकर्ता जैव/रासायनिक प्रतिक्रियाओं को पूरा करने के लिए रिएक्टरों का उपयोग करते हैं । कार्य दक्षता में सुधार करते हुए अभिकर्षक खपत को कम करने के लिए रिएक्टर के आकार को कम करने और प्रायोगिक थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण प्रयास किए गए हैं । दोनों पहलुओं का उद्देश्य शोधकर्ताओं को भारी कार्यभार से मुक्त करना, लागत कम करना और अनुसंधान और विकास को तेज करना है । हमारे पास प्रतिक्रिया की मात्रा और थ्रूपुट के दृष्टिकोण से रिएक्टर प्रौद्योगिकियों के विकास के बारे में एक स्पष्ट ऐतिहासिक रोडमैप है: एकल बीकर्स/फ्लास्क/टेस्ट-ट्यूब, मिलीलीटर ट्यूब, माइक्रोलीटर ट्यूब, माइक्रोलीटर 8-ट्यूब स्ट्रिप्स, माइक्रोलीटर 96/384/1536-वेल प्लेट, और माइक्रोफ्लुइडिक नैनोलीटर/पिकोलिटर/फेमोलीटर रिएक्टर1,,2,,3,,4,5,,6,,7।, पिछले दशकों में सेमीकंडक्टर उद्योग में एकीकृत सर्किट चिप्स पर ट्रांजिस्टर के फीचर आकार को आकार देने के अनुरूप बायो/केमिकल माइक्रोरिएक्टर वॉल्यूम डिडक्शन और सिस्टम इंटीग्रेशन से गुजर रहे हैं । इस तरह के छोटे पैमाने के उपकरणों का सेल-आधारित या सेल-मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान, बायोमैन्यूफैक्चरिंग, और उच्च-थ्रूपुट प्रोटोटाइप और स्क्रीनिंग8,,9,10, 11,,,12पर गहरा प्रभाव पड़ा है।,11 यह पत्र एक अद्वितीय बूंद सरणी प्रौद्योगिकी के विकास पर हमारे हाल के प्रयास का वर्णन करता है और सीएफपीएस13में अपने आवेदन को दर्शाता है, जो सिंथेटिक जीव विज्ञान और आणविक स्क्रीनिंग समुदायों के लिए एक मौलिक तकनीकहै। विशेष रूप से, हम जानबूझकर फेमडा डिवाइस को सभी के लिए सुलभ बनाने के लिए एक अनुकूलित और कम लागत वाला प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। लघुकृत डिवाइस के लिए कम लागत और आसानी से संभाल प्रोटोकॉल विश्वविद्यालयों के शैक्षिक प्रयोजनों में योगदान देगा और प्रौद्योगिकी को फैलाने में मदद करेगा।
फेमडा एक प्लैनर ग्लास सब्सट्रेट पर 10 6 प्रति1 सेमी2 के अल्ट्राहाई डेंसिटी पर फेमोलीटर बूंदों को तैयार करता है। हमने सब्सट्रेट पर माइक्रोचैम्बर सरणी उत्पन्न करने के लिए पूर्वनिर्धारित स्थितियों पर एक हाइड्रोफोबिक बहुलक, CYTOP15,ग्लास सब्सट्रेट पर और चुनिंदा रूप से नक़्क़ाशीदार (हटाया) CYTOP को लेपित किया। इस प्रकार, परिणामी माइक्रोचैम्बर एक हाइड्रोफोबिक साइडवॉल (CYTOP) और एक हाइड्रोफिलिक बॉटम (ग्लास) से बना है। जब क्रमिक रूप से नमूनों की सतह पर पानी और तेल बहते हैं, तो पानी को फंसाया जा सकता है और माइक्रोचेम्बर्स में सील किया जा सकता है। हाइड्रोफिलिक-इन-हाइड्रोफोबिक संरचना माइक्रोचेम्बर्स के बाहर पानी को पीछे हटाने, व्यक्तिगत माइक्रोरिएक्टरों को अलग करने और फेमोलीटर अंतरिक्ष के अंदर एक छोटे जलीय समाधान को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। अद्वितीय संपत्ति को पानी में तेल की बूंदों और लिपिड बाइलेयर माइक्रोकंभागणियों16, 17,17की तैयारी के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था। प्रोटोटाइप डिवाइस16की तुलना में, हमने सबसे पहले CYTOP बहुलक को पूरी तरह से हटाने के साथ-साथ ग्लास बॉटम के पूर्ण जोखिम का एहसास करने के लिए माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रिया को अनुकूलित किया। CYTOP एक विशेष फ्लोरोपॉलिमर है जिसमें ग्लास, प्लास्टिक और सिलिकॉन जैसे पारंपरिक माइक्रोरिएक्टर सामग्रियों की तुलना में बेहद कम सतह तनाव (19 mN/m) कम है। इसके अच्छे ऑप्टिकल, इलेक्ट्रिकल और केमिकल परफॉर्मेंस का उपयोग माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों 18 ,,,,19, 20, 21,1822,,23,,,24के सतह उपचार में पहले ही किया जा चुका है ।2324 फेमडा प्रणाली में, CYTOP सतह पर तेल की अच्छी गीलाई प्राप्त करने के लिए, तेल की सतह तनाव ठोस सतह25की तुलना में कम होना चाहिए। अन्यथा, ठोस सतह के संपर्क में तरल तेल सतह पर फैलने के बजाय गोलाकार हो जाता है। इसके अलावा, हमने पाया कि कुछ लोकप्रिय परफ्लोरोकार्बन तेल (जैसे, 3एम एफसी-40)16 और हाइड्रोफ्लोरोरोथर तेल (उदाहरण के लिए, 3M नोवेक श्रृंखला) CYTOP के अरूपात्मक आकृति विज्ञान के परिणामस्वरूप CYTOP को भंग कर सकते हैं, जो मात्रात्मक माप के लिए घातक है और बूंदों के बीच क्रॉस-संदूषण के मामले में संदिग्ध होगा। सौभाग्य से, हमने एक जैव संगत और पर्यावरण के अनुकूल तेल की पहचान की जो कम (< 19 mN/m) सतह तनाव13का प्रदर्शन करता है । हमें एक नया सर्फेक्टेंट भी मिला जो चयनित तेल में घुल सकता है और कम एकाग्रता में कार्य कर सकता है (0.1%, कम से कम 10 गुना कम पहले की रिपोर्ट किए गए लोकप्रिय लोगों की तुलना में26,,27)13। परिणामस्वरूप पानी/तेल इंटरफेस को सर्फेक्टेंट द्वारा स्थिर किया जा सकता है। तेल की उच्च वाष्पीकरण दर के कारण, तेल के साथ फ्लश के बाद, हमने माइक्रोचेम्बर्स को सील करने के लिए पहले एक को बदलने के लिए एक और जैव संगत और पर्यावरण के अनुकूल तेल लागू किया। हम पहले तेल (ASAHIKLIN AE-3000 के साथ 0.1 wt% SURFLON एस-386) “फ्लश तेल” और दूसरा तेल (Fomblin Y25) “सीलिंग तेल,” क्रमशः कहते हैं।
दो कदम तेल-सीलिंग रणनीति मिनटों के भीतर और परिष्कृत इंस्ट्रूमेंटेशन के बिना फेमोलेटर बूंद सरणी के एक मजबूत गठन का एहसास कर सकती है। वाष्पीकरण की समस्या के कारण,28की मात्रा से छोटे माइक्रोरिएक्टर उत्पन्न करना चुनौतीपूर्ण माना गया है। फेमडीए ने माइक्रोरिएक्टर/बूंदों की तैयारी के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्रियों और प्रक्रियाओं को व्यवस्थित रूप से अनुकूलित करके इस मुद्दे को संबोधित किया । परिणामी बूंदों की कई उल्लेखनीय विशेषताओं में उच्च एकरूपता (या मोनोडिस्पर्सिटी), स्थिरता और फेमटोलिटर पैमाने पर जैव अनुकूलता शामिल है। बूंद की मात्रा का भिन्नता (सीवी) का गुणांक केवल 3% है (सूक्ष्म छवियों के लिए सुधार के बिना), दुनिया में बूंद प्लेटफार्मों के बीच सबसे छोटा सीवी, जो अत्यधिक समानांतर और मात्रात्मक माप सुनिश्चित करता है। फेमटोलिनर बूंद कमरे के तापमान पर बूंदों के बीच क्रॉस-संदूषण के बिना कम से कम 24 घंटे के लिए स्थिर है, जो एक विश्वसनीय समय-पाठ्यक्रम माप के लिए मूल्यवान है। जैव अनुकूलता के बारे में, हम फेमटोलिटर बूंद में एक एकल-कॉपी टेम्पलेट डीएनए से विभिन्न प्रोटीनों को संश्लेषित करने में सफल रहे, जिन्हें पहले कठिन या अक्षम29,,30माना गया था। यह स्पष्ट करने के योग्य होगा कि फेमडा में संश्लेषित होने में सक्षम कुछ प्रोटीन को अन्य बूंद प्रणालियों में संश्लेषित क्यों नहीं किया जा सकता है। फेमडा केवल एक तकनीकी उन्नति नहीं थी, बल्कि एक अभूतपूर्व मात्रात्मक माप का भी एहसास हुआ जो प्रोटीन उपज (जैसा कि बूंद की फ्लोरेसेंस तीव्रता से परिलक्षित होता है) को प्रत्येक बूंद में टेम्पलेट डीएनए अणुओं की संख्या में सहसंबंधित कर सकता है। नतीजतन, फेमडा-आधारित सीएफपीएस से बूंदों की फ्लोरेसेंस तीव्रता के हिस्टोग्राम ने एक असतत वितरण दिखाया जिसे समान पीक-टू-पीक अंतराल के गॉसियन वितरण की राशि से अच्छी तरह से फिट किया जा सकता है। इसके अलावा, डीएनए अणुओं की विभिन्न संख्याओं वाली बूंदों की घटना की संभावना एक पॉइसन वितरण31के लिए एकदम सही फिट थी। इस प्रकार, प्रत्येक बूंद में विभिन्न प्रोटीन उपज असतत वितरण के आधार पर सामान्यीकृत किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण सुविधा हमें स्पष्ट तीव्रता से एंजाइमेटिक गतिविधि जानकारी को अलग करने की अनुमति देती है, जो अभी तक अन्य माइक्रोरिएक्टर प्लेटफार्मों के साथ उपलब्ध नहीं है। मौजूदा माइक्रोफ्लुइडिक सेल /ड्रॉपलेट सॉर्टिंग सिस्टम पूरी तरह से स्वचालित छंटाई में कुशल होते हैं और नमूनों को ध्यान केंद्रित करने में अच्छे होते हैं लेकिन कभी – कभी विश्लेषणात्मक पहलू32,,33में अपेक्षाकृत व्यापक या लंबी पूंछ वाले हिस्टोग्राम का उत्पादन कर सकते हैं। हमारी अत्यधिक मात्रात्मक और जैव संगत फेमडीए प्रणाली माइक्रोरिएक्टर विकास के क्षेत्र में एक नया बेंचमार्क और एक उच्च विश्लेषणात्मक मानक सेट करता है।
बूंदों को तैयार करने के लिए जिन तेलों और सर्फेक्टेंट का उपयोग किया जा सकता है , वे अभी भी बहुतसीमितहैं . फेमडा में स्थापित ASAHIKLIN AE-3000 और SURFLON S-386 का संयोजन जलीय चरण और तेल चरण13के बीच फिजियोकेमिकल इंटरफेस के बढ़ते शस्त्रागार का एक नया सदस्य है। फेमडा में नया इंटरफ़ेस शारीरिक रूप से स्थिर, रासायनिक रूप से निष्क्रिय है, और कई प्रकार के प्रोटीन13के लिए जटिल प्रतिलेखन, अनुवाद और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन मशीनरी के साथ जैविक रूप से संगत है। यह एक प्रोटीन खोजने के लिए आकर्षक होगा जिसे बूंद सेटिंग्स में संश्लेषित नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, नैनोलीटर और पिकालिएटर रिएक्टर सिस्टम35,,36की तुलना में फेमोलीटर ड्रॉपलेट सिस्टम में अभिकर् ता की लागत की बचत अधिक स्पष्ट है। विशेष रूप से, अक्सर एक बड़ी मृत मात्रा होगी, जो मुख्य रूप से ट्यूबिंग या बाहरी आपूर्ति के कारण होती है, माइक्रोफ्लुइडिक ड्रॉपलेट जनरेशन सिस्टम में लेकिन हमारे फेमडा में नहीं। सरणी प्रारूप को हर एक रिएक्टर37के लिए दोहराया और विस्तृत सूक्ष्म लक्षण वर्णन (तथाकथित उच्च सामग्री विश्लेषण के समान) द्वारा भी इष्ट किया जाता है, न कि तेजी से चलती वस्तु के लिए केवल एक स्नैपशॉट के बजाय। फेमटोलिएटर स्केल ने उंगली के आकार के क्षेत्र में १,०००,००० से अधिक रिएक्टरों के एकीकरण को सक्षम किया, जबकि नैनोलिटर रिएक्टरों की एक ही संख्या (यदि यह मौजूद है) को वर्ग मीटर क्षेत्र में आवश्यकता होती है, जो निस्संदेह ऐसी प्रणाली का निर्माण या उपयोग करने के लिए अव्यावहारिक होगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
फेमडा में अत्यधिक समान, स्थिर और जैव संगत बूंदों के आधार पर अत्यधिक मात्रात्मक माप ने असतत वितरण को सक्षम किया, हमारे अध्ययन की अनूठी विशेषता दूसरों से अलग है। हमने इस पेपर में माइक्रोफैब्रिकेशन और ड्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को जेएसपीएस काकेनही ग्रांट नंबर JP18K14260 और मरीन-अर्थ साइंस एंड टेक्नोलॉजी के लिए जापान एजेंसी के बजट द्वारा समर्थित किया गया था। हम लक्षण वर्णन सुविधाएं प्रदान करने के लिए शिगेरू डेगुची (जेएसटेक) और टेत्सुरो इकुटा (JAMSTEC) को धन्यवाद देते हैं। हम वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर समर्थन के लिए केन ताकाई (JAMSTEC) का शुक्रिया अदा करते हैं। माइक्रोफैब्रिकेशन टोक्यो विश्वविद्यालय के टेकडा सेंटांची सुपरक्लीनरूम में आयोजित किया गया था, जो शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (एमईएक्सटी), जापान, ग्रांट नंबर JPMXP09F19UT0087 के “नैनोटेक्नोलॉजी प्लेटफॉर्म प्रोग्राम” द्वारा समर्थित था।
Materials
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| 2-propanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. |
| 3D laser scanning confocal microscope | Lasertec | OPTELICS HYBRID | Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable. |
| 50 mL syringe | Terumo | SS-50LZ | |
| 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate | Thermo Fisher Scientific | D6567 | Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide |
| Acetone | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.8%. |
| Air blower | Hozan | Z-263 | |
| Aluminum block | BIO-BIK | AB-24M-02 | |
| Aluminum microtube stand | BIO-BIK | AB-136C | |
| ASAHIKLIN AE-3000 | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| BEMCOT PS-2 wiper | Ozu | 028208 | |
| Biopsy punch with plunger | Kai | BPP-10F | |
| Cover glass | Matsunami Glass | No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) | Size-customized. |
| Cover glass staining rack | Nakayama | 803-131-11 | |
| CRECIA TechnoWipe clean wiper | Nippon Paper Crecia | C100-M | |
| Cutting mat | GE Healthcare | WB100020 | |
| CYTOP | AGC | CTL-816AP | |
| Deaeration mixer | Thinky | AR-100 | |
| Desktop cutter | Roland | STIKA SV-8 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 300 MIF | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.) |
| Double-coated adhesive Kapton film tape | Teraoka Seisakusho | 7602 #25 | |
| Ethanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.5%. |
| Fiji | Version: ImageJ 1.51n | ||
| Flat-cable cutter | Tokyo-IDEAL | MT-0100 | |
| Fomblin oil | Solvay | Y25, or Y25/6 | Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available. |
| Hot plate | AS ONE | TH-900 | |
| Injection needle | Terumo | NN-2270C | 22G × 70 mm |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required. |
| KaleidaGraph | Synergy | Version: 4.5 | |
| Mask aligner | SUSS | MA-6 | Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable. |
| MICROMAN pipette | GILSON | E M250E | Capillary piston tip: CP250 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Version: 16.16.15 | |
| Mini vacuum chamber | AS ONE | MVP-100MV | |
| Nuclease-free water | NIPPON GENE | 316-90101 | |
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PCR tube | NIPPON Genetics | FG-021D/SP | |
| Petri dish | AS ONE | GD90-15 | Diameter 90 mm, height 15 mm. |
| Photoresist | AZ Electronic Materials | AZ P4903 | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative. |
| Plate reader | BioTek | POWERSCAN HT | |
| Polyethelene gloves | AS ONE | 6-896-02 | Trade name: Saniment. |
| PURExpress in vitro protein synthesis kit | New England Biolabs | E6800S or E6800L | For cell-free protein synthesis reaction. |
| Reactive-ion etching system | Samco | RIE-10NR | Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.) |
| RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | |
| Scotch tape | 3M | 810-1-18D | |
| Sodium hydroxide solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-09575 | 8 M concentration; danger. |
| Spin coater | Oshigane | SC-308 | |
| SURFLON S-386 surfactant | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| SYLGARD 184 silicone elastomer | Dow | Sylgard184 | Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m). |
| Tweezers | Ideal-tek | 2WF.SA.1 2A |
|
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | ASU-2M | |
| Vacuum chuck | Oshigane | (Customized) | Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm). |
References
- Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
- Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
- Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
- Zhang, Y., Jiang, X., Fan, C. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. , 113-153 (2013).
- Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
- Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
- Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
- Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
- Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
- Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
- Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
- Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
- Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
- Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
- Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
- Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
- Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
- Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
- Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
- de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
- Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
- Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
- Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
- Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
- Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
- Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
- Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
- Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
- Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
- Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn’t the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C., Conn, P. M. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. , 143-162 (2010).
- Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
- Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
- Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E. . Digital image processing. , (2018).
- Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).
