En femtoliter droplet array for massivt parallell proteinsyntese fra enkelt DNA molekyler

Summary

Det overordnede målet med protokollen er å forberede over en million bestilte, ensartede, stabile og biokompatible femtoliterdråper på et 1 cm² planar substrat som kan brukes til cellefri proteinsyntese.

Abstract

Fremskritt innen romlig oppløsning og deteksjonsfølsomhet for vitenskapelig instrumentering gjør det mulig å bruke små reaktorer for biologisk og kjemisk forskning. For å møte etterspørselen etter mikroreaktorer med høy ytelse utviklet vi en femtoliterdråpearray (FemDA) og eksemplifiserte applikasjonen i massivt parallelle cellefrie proteinsyntese (CFPS) reaksjoner. Over en million ensartede dråper ble lett generert innenfor et fingerstørrelsesområde ved hjelp av en to-trinns oljeforseglingsprotokoll. Hver dråpe ble forankret i et femtoliter mikrokammer bestående av en hydrofil bunn og en hydrofob sidevegg. Den hybride hydrofile-i-hydrofobe strukturen og de dedikerte tetningsoljer og overflateaktive midler er avgjørende for å stikke femtoliter vandig løsning i femtoliter plass uten fordampningstap. Femtoliterkonfigurasjonen og den enkle strukturen til FemDA-enheten tillot minimalt reagensforbruk. Den ensartede dimensjonen til dråpereaktorene gjorde store kvantitative og tidskursmålinger overbevisende og pålitelige. FemDA-teknologien korrelerte proteinutbyttet til CFPS-reaksjonen med antall DNA-molekyler i hver dråpe. Vi strømlinjeformet prosedyrene om mikrofabrikasjon av enheten, dannelsen av femtoliterdråpene og oppkjøpet og analysen av mikroskopiske bildedata. Den detaljerte protokollen med den optimaliserte lave driftskostnaden gjør FemDA-teknologien tilgjengelig for alle som har standard renromsfasiliteter og et konvensjonelt fluorescensmikroskop på sitt eget sted.

Introduction

Forskere bruker reaktorer for å utføre bio/ kjemiske reaksjoner. Det er gjort betydelige anstrengelser for å redusere størrelsen på reaktoren og øke eksperimentell gjennomstrømning for å redusere reagensforbruket samtidig som arbeidseffektiviteten forbedres. Begge aspektene tar sikte på å frigjøre forskere fra en tung arbeidsbelastning, redusere kostnadene og fremskynde forskning og utvikling. Vi har et klart historisk veikart om utviklingen av reaktorteknologiene fra synspunktet til reaksjonsvolumer og gjennomstrømning: enkeltbeger/kolbe/reagensrør, milliliter rør, mikroliter rør, mikroliter 8-rørsstrimler, mikroliter 96/384/1536-brønn plate, og mikrofluidisk nanoliter / picoliter / femtoliter reaktorer^{1,2,3,4,5,6,7}. Analogt med nedbemanning av funksjonsstørrelsen på transistorer på integrerte kretsbrikker i halvlederindustrien de siste tiårene, går bio / kjemiske mikroreaktorer gjennom volumreduksjon og systemintegrasjon. Slike småskala verktøy har hatt en dyp innvirkning på cellebasert eller cellefri syntetisk biologi, biomanufacturing, og høy gjennomstrømning prototyping og screening^{8,,9,10,,11,12}. Dette papiret beskriver vår nylige innsats på utviklingen av en unik dråpe array teknologi og demonstrerer sin anvendelse i CFPS^13,en grunnleggende teknologi for syntetisk biologi og molekylær screening samfunn¹⁴. Spesielt tilbyr vi med vilje en optimalisert og rimelig protokoll for å gjøre FemDA-enheten tilgjengelig for alle. Den rimelige og lett-å-håndtere protokollen for miniatyrisert enhet ville bidra til pedagogiske formål universiteter og bidra til å spre teknologien.

FemDA forbereder femtoliter dråper med en ultrahøy tetthet på 10⁶ per 1 cm² på et planar glass substrat. Vi belagt en hydrofob polymer, CYTOP^15,på glasssubstratet og selektivt etset (fjernet) CYTOP ved forhåndsdefinerte posisjoner for å generere et mikrokammerarray på substratet. Dermed består det resulterende mikrokammeret av en hydrofob sidevegg (CYTOP) og en hydrofil bunn (glass). Når sekvensielt strømmer vann og olje over den mønstrede overflaten, kan vannet bli fanget og forseglet i mikrokamrene. Den hydrofile-i-hydrofobe strukturen er avgjørende for å avvise vann utenfor mikrokamrene, isolere individuelle mikroreaktorer og beholde en liten vandig løsning inne i femtoliterrommet. Den unike egenskapen ble vellykket søkt om fremstilling av vann-i-olje dråper og lipid bilayer mikrokompartments^16,17. Sammenlignet med prototypeenheten^16,optimaliserte vi først mikrofabrikasjonsprosessen for å realisere en fullstendig fjerning av CYTOP-polymeren, samt en full eksponering av glassbunnen. CYTOP er en spesiell fluoropolymer med ekstremt lav overflatespenning (19 mN/m) lavere enn for konvensjonelle mikroreaktormaterialer som glass, plast og silikon. Den gode optiske, elektriske og kjemiske ytelsen er allerede benyttet i overflatebehandling av mikrofluidiske enheter^{18,,19,,20,,21,,22,,23,,24}. I FemDA-systemet, for å oppnå god fukting av oljen på CYTOP-overflaten, må overflatespenningen til oljen være lavere enn den av den faste overflaten²⁵. Ellers har væskeoljen i kontakt med den faste overflaten en tendens til å bli sfærisk i stedet for å spre seg over overflaten. Dessuten fant vi at noen populære perfluorokarbonoljer (f.eks. 3M FC-40)¹⁶ og hydrofluoroetheroljer (f.eks. 3M Novec-serien) kan oppløse CYTOP som følge av den amorfe morfologien til CYTOP, som er dødelig for kvantitativ måling og ville være tvilsom når det gjelder krysskontaminering blant dråper. Heldigvis identifiserte vi en biokompatibel og miljøvennlig oljeutpeende lavere (< 19 mN/m) overflatespenning¹³. Vi fant også et nytt overflateaktivt middel som kan oppløses i den valgte oljen og fungere i lav konsentrasjon (0,1%, minst 10 ganger lavere enn tidligere rapportert populære^26,27)¹³. Det resulterende vann-/oljegrensesnittet kan stabiliseres av overflateaktivt middel. På grunn av oljens høye fordampningshastighet, etter spylingen med oljen, brukte vi en annen biokompatibel og miljøvennlig olje for å erstatte den første til å forsegle mikrokamrene. Vi kaller den første oljen (ASAHIKLIN AE-3000 med 0,1 wt % SURFLON S-386) “flush oil” og den andre oljen (Fomblin Y25) henholdsvis “tetningsolje”.

Den to-trinns oljeforseglingsstrategien kan realisere en robust dannelse av femtoliterdråpearrayet i løpet av minutter og uten sofistikert instrumentering. På grunn av fordampningsproblemet har det vært ansett som utfordrende å generere mikroreaktorer mindre enn picolitervolumer²⁸. FemDA tok opp dette problemet ved systematisk å optimalisere materialene og prosessene som brukes til fremstilling av mikroreaktorer/dråper. Flere bemerkelsesverdige trekk ved de resulterende dråpene inkluderer høy ensartethet (eller monodispersitet), stabilitet og biokompatibilitet på femtoliterskalaen. Variasjonskoeffisienten (CV) av dråpevolumet er bare 3 % (uten vignetter korreksjon for mikroskopiske bilder), den minste CV-en blant dråpeplattformer i verden, noe som sikrer en svært parallell og kvantitativ måling. Femtoliterdråpen er stabil i minst 24 timer uten krysskontaminering blant dråper ved romtemperatur, noe som er verdifullt for en pålitelig tidskursmåling. Når det gjelder biokompatibilitet, lyktes vi i å syntetisere ulike proteiner fra en enkeltkopi mal DNA i femtoliter dråpe, som tidligere hadde vært ansett som vanskelig eller ineffektiv^29,30. Det ville være verdig å belyse hvorfor noen proteiner som er i stand til å bli syntetisert i FemDA kan ikke syntetiseres i andre dråpesystemer. FemDA var ikke bare et teknisk fremskritt, men innså også en enestående kvantitativ måling som kan korrelere proteinutbyttet (som gjenspeiles av fluorescensintensiteten til dråpene) til antall mal-DNA-molekyler i hver dråpe. Som et resultat viste histogrammet av fluorescensintensiteten av dråper fra FemDA-baserte CFPS en diskret fordeling som kan monteres pent av en sum av gaussiske distribusjoner av like topp-til-topp intervaller. Videre var sannsynligheten for forekomst av dråper som inneholder forskjellige antall DNA-molekyler en perfekt passform til en Poisson-fordeling³¹. Dermed kan det forskjellige proteinutbyttet i hver dråpe normaliseres basert på den diskrete fordelingen. Denne kritiske funksjonen gjør det mulig for oss å skille den enzymatiske aktivitetsinformasjonen fra den tilsynelatende intensiteten, som ikke har vært tilgjengelig med andre mikroreaktorplattformer ennå. Eksisterende mikrofluidiske celle / dråpesorteringssystemer er dyktige i helautomatisk sortering og god til å konsentrere prøver, men noen ganger kan bare sende ut et relativt bredt eller langhalet histogram i det analytiske aspektet^32,33. Vårt svært kvantitative og biokompatibele FemDA-system setter en ny standard og en høy analytisk standard innen mikroreaktorutvikling.

Oljer og tensider som kan brukes til fremstilling av dråper er fortsatt svært begrenset³⁴. Kombinasjonen av ASAHIKLIN AE-3000 og SURFLON S-386 etablert i FemDA er et nytt medlem av det voksende arsenalet av det fysiokjemiske grensesnittet mellom den vandige fasen og oljefasen¹³. Det nye grensesnittet i FemDA er fysisk stabilt, kjemisk inert, og biologisk kompatibel med komplekse transkripsjon, oversettelse, og post-translasjonelle modifisering maskiner for mange typer proteiner¹³. Det ville være ganske attraktivt å finne et protein som ikke kan syntetiseres i dråpeinnstillingene i stedet. Dessuten er kostnadsbesparelsen av reagenser tydeligere i femtoliterdråpesystemet enn det i nanoliter- og picoliterreaktorsystemer^35,36. Spesielt vil det ofte være et stort dødt volum, som hovedsakelig skyldes rør eller eksterne forsyninger, i mikrofluidiske dråpegenereringssystemer, men ikke i vår FemDA. Matriseformatet favoriseres også av gjentatt og detaljert mikroskopisk karakterisering (ligner på såkalt analyse av høyt innhold) for hver enkelt reaktor³⁷, i stedet for bare et enkelt øyeblikksbilde for et objekt i rask bevegelse. Femtoliterskalaen gjorde det mulig å integrere over en million reaktorer på et fingerstørrelsesområde, mens samme antall nanoliterreaktorer (hvis den eksisterer) krever over kvadratmeterområdet, noe som utvilsomt ville være upraktisk å produsere eller bruke et slikt system.

Protocol

1. Mikrofabrikasjon av femtoliter mikrokammer array substrat MERK: Utfør følgende mikrofabrikasjonseksperiment i et renrom. Bruk hansker og en renromsdress før du går inn i renrommet. Rengjøringsdeksel glass substrat Sett dekkglasset på et dekkglassfargestativ. Soniker dekkglasset i 8 M natriumhydroksid (NaOH) i 15 min ved romtemperatur (RT).FORSIKTIG: NaOH i høye konsentrasjoner er svært farlig for hud og øye. Håndter den forsiktig uten sprut. Ta sta…

Representative Results

Mikrofabrikasjonsprosessen består av substratrengjøring, overflatefunksjonalisering, CYTOP-belegg, fotolittografi, tørr etsing, fotoresist stripping og sluttrengjøring. Viktigere, den presenterte protokollen tillot fullstendig fjerning av hydrofob CYTOP polymer inne i mikrokamrene Figur 3A), produsere en svært parallell hydrofil-i-hydrofob struktur på en standard deksel glass substrat. Ved hjelp av oljeforseglingsprotokollen ble den ensartede dimensjonen til de resulterende dråpene ve…

Discussion

Den svært kvantitative målingen basert på de svært ensartede, stabile og biokompatible dråpene i FemDA gjorde det mulig å fordele diskrete distribusjonen, det unike ved studien vår som skiller seg fra andre. Vi systematisk optimalisert og detaljert mikrofabrikasjon og dråpedannelse prosesser i dette papiret. Det er flere kritiske trinn i den etablerte protokollen.

For det første bestemmer det ensartede belegget av svært viskøs CYTOP-polymer på det rektangulære tynne glasssubstrate…

Materials

(3-aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
1 mL syringe	Terumo	SS-01T
2-propanol	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope	Lasertec	OPTELICS HYBRID	Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe	Terumo	SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate	Thermo Fisher Scientific	D6567	Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use. Purity 99.8%.
Air blower	Hozan	Z-263
Aluminum block	BIO-BIK	AB-24M-02
Aluminum microtube stand	BIO-BIK	AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000	AGC	(Test sample)	Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper	Ozu	028208
Biopsy punch with plunger	Kai	BPP-10F
Cover glass	Matsunami Glass	No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness)	Size-customized.
Cover glass staining rack	Nakayama	803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper	Nippon Paper Crecia	C100-M
Cutting mat	GE Healthcare	WB100020
CYTOP	AGC	CTL-816AP
Deaeration mixer	Thinky	AR-100
Desktop cutter	Roland	STIKA SV-8
Developer	AZ Electronic Materials	AZ 300 MIF	AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape	Teraoka Seisakusho	7602 #25
Ethanol	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use. Purity 99.5%.
Fiji			Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter	Tokyo-IDEAL	MT-0100
Fomblin oil	Solvay	Y25, or Y25/6	Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate	AS ONE	TH-900
Injection needle	Terumo	NN-2270C	22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti-E	Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph	Synergy		Version: 4.5
Mask aligner	SUSS	MA-6	Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette	GILSON	E M250E	Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel	Microsoft		Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber	AS ONE	MVP-100MV
Nuclease-free water	NIPPON GENE	316-90101
Parafilm	Amcor	PM-996
PCR tube	NIPPON Genetics	FG-021D/SP
Petri dish	AS ONE	GD90-15	Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist	AZ Electronic Materials	AZ P4903	AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader	BioTek	POWERSCAN HT
Polyethelene gloves	AS ONE	6-896-02	Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit	New England Biolabs	E6800S or E6800L	For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system	Samco	RIE-10NR	Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor	New England Biolabs	M0314S
Scotch tape	3M	810-1-18D
Sodium hydroxide solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	194-09575	8 M concentration; danger.
Spin coater	Oshigane	SC-308
SURFLON S-386 surfactant	AGC	(Test sample)	Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer	Dow	Sylgard184	Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers	Ideal-tek	2WF.SA.1 2A
Ultrasonic cleaner	AS ONE	ASU-2M
Vacuum chuck	Oshigane	(Customized)	Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).