En Femtoliter Droplet Array för massivt parallell proteinsyntes från single DNA-molekyler

Summary

Det övergripande målet med protokollet är att förbereda över en miljon beställda, enhetliga, stabila och biokompatibla femtoliterdroppar på ett 1 cm² planarsubstrat som kan användas för cellfri proteinsyntes.

Abstract

Framsteg inom rumslig upplösning och detektionskänslighet för vetenskaplig instrumentering gör det möjligt att tillämpa små reaktorer för biologisk och kemisk forskning. För att möta efterfrågan på högpresterande mikroreaktorer utvecklade vi en femtoliterdroppsystem (FemDA) och exemplifierade dess tillämpning i massivt parallella cellfria proteinsynteser (CFPS) reaktioner. Över en miljon enhetliga droppar genererades lätt inom ett finger-storlek område med hjälp av en tvåstegs olja-tätning protokoll. Varje droppe var förankrad i en femtoliter microchamber består av en hydrofil botten och en hydrofoba sidovägg. Hybrid hydrofil-i-hydrofoba struktur och dedikerade tätningsoljor och ytaktiva ämnen är avgörande för att stabilt behålla femtoliter vattenlösning i femtoliter utrymmet utan avdunstning förlust. Femtolatorkonfigurationen och den enkla strukturen hos FemDA-enheten tillät minimal reagensförbrukning. Den enhetliga dimensionen av droppreaktorerna gjorde storskaliga kvantitativa och tidsloppsmätningar övertygande och tillförlitliga. FemDA-tekniken korrelerade proteinutbytet för CFPS-reaktionen med antalet DNA-molekyler i varje droppe. Vi effektiviserade förfarandena om mikrotillverkning av enheten, bildandet av femtoliterdropparna och förvärvet och analysen av mikroskopiska bilddata. Det detaljerade protokollet med optimerad låg driftskostnad gör FemDA-tekniken tillgänglig för alla som har standardrenrumsfaciliteter och ett konventionellt fluorescensmikroskop på sitt eget ställe.

Introduction

Forskare använder reaktorer för att utföra bio/kemiska reaktioner. Det finns betydande ansträngningar som har gjorts för att minska reaktorns storlek och öka den experimentella genomströmningen för att minska reagensförbrukningen och samtidigt förbättra arbetseffektiviteten. Båda aspekterna syftar till att befria forskare från en tung arbetsbelastning, minska kostnaderna och påskynda forskning och utveckling. Vi har en tydlig historisk färdplan för utvecklingen av reaktortekniken med tanke på reaktionsvolymer och genomströmning: enstaka bägare/kolv/provrör, milliliterrör, mikroliterrör, mikroliter 8-rörsremsor, mikroliter 96/384/1536-brunnsplatta och mikrofluidisk nanoliter/picoliter/femtoliterreaktorer^{1,,2,,3,,4,,5,,6,7}. Analogt med nedskärningar av funktionen storlek transistorer på integrerade kretschips i halvledarindustrin under de senaste decennierna, bio / kemiska mikroreaktorer går igenom volymminskning och systemintegration. Sådana småskaliga verktyg har haft en djupgående inverkan på cellbaserad eller cellfri syntetisk biologi, biotillverkning och prototyper med hög genomströmning^{8,,9,10,11,12}. Detta dokument beskriver vår senaste insats för utveckling av en unik droplet array teknik och visar dess tillämpning i CFPS¹³, en grundläggande teknik för syntetisk biologi och molekylär screening samhällen¹⁴. I synnerhet tillhandahåller vi avsiktligt ett optimerat och billigt protokoll för att göra FemDA-enheten tillgänglig för alla. Det billiga och lätthanterliga protokollet för den miniatyriserade enheten skulle bidra till universitetens utbildningsändamål och bidra till att sprida tekniken.

FemDA förbereder femtolter droppar på en ultrahigh densitet på 10⁶ per 1 cm² på en plana glassubstrat. Vi belagda en hydrofoba polymer, CYTOP¹⁵, på glassubstratet och selektivt etsade (bort) CYTOP vid fördefinierade positioner för att generera en mikrokammare array på substratet. Således består den resulterande mikrokammaren av en hydrofoba sidovägg (CYTOP) och en hydrofil botten (glas). När sekventiellt rinner vatten och olja över den mönstrade ytan, kan vattnet fångas och förseglas i mikrokammare. Den hydrofila-i-hydrofoba strukturen är avgörande för att stöta bort vatten utanför mikrokammare, isolera enskilda mikroreaktorer, och behålla en liten vattenlösning inne i femtolter utrymmet. Den unika egenskapen tillämpades framgångsrikt för beredning av vatten-i-olja droppar och lipid bilayer mikrokompar^16,17. Jämfört med prototypenheten¹⁶optimerade vi först mikrotillverkningsprocessen för att förverkliga ett fullständigt avlägsnande av CYTOP-polymeren samt en fullständig exponering av glasbotten. CYTOP är en speciell fluorpolymer med extremt låg ytspänning (19 mN/m) lägre än för konventionella mikroreaktormaterial som glas, plast och silikon. Dess goda optiska, elektriska och kemiska prestanda har redan utnyttjats vid ytbehandling av mikrofluidiska enheter^{18,,19,20,21,22,23,24}. I FemDA-systemet, för att uppnå god vätning av oljan på CYTOP-ytan, måste oljans ytspänning vara lägre än den fasta^{ytans 25}. Annars tenderar den flytande oljan som kommer i kontakt med den fasta ytan att bli sfärisk snarare än att sprida sig över ytan. Dessutom fann vi att vissa populära perfluorkolväten oljor (t.ex., 3M FC-40)¹⁶ och fluororoether oljor (t.ex., 3M Novec-serien) kan lösa cytop som ett resultat av amorf morfologi av CYTOP, vilket är dödligt för kvantitativ mätning och skulle ifrågasättas i form av korskontaminering bland droppar. Lyckligtvis identifierade vi en biokompatibel och miljövänlig olja uppvisar lägre (< 19 mN / m) ytspänning¹³. Vi hittade också ett nytt ytaktivt företag som kan lösas upp i den valda oljan och funktion i en låg koncentration (0,1%, minst 10 gånger lägre än tidigare rapporterats populära^26,27)¹³. Det resulterande vatten-/oljegränssnittet kan stabiliseras av ytaktivt. På grund av oljans höga avdunstningshastighet, efter spolningen med oljan, applicerade vi en annan biokompatibel och miljövänlig olja för att ersätta den första för att täta mikrokammare. Vi kallar den första oljan (ASAHIKLIN AE-3000 med 0,1 wt % SURFLON S-386) “spololja” och den andra oljan (Fomblin Y25) “tätningsoljan”, respektive.

Den tvåstegs oljetätningsstrategin kan förverkliga en robust bildning av femtolterdropparsystemet inom några minuter och utan sofistikerad instrumentering. På grund av avdunstningsproblemet har det ansetts vara svårt att generera mikroreaktorer som är mindre än picolitervolymerna²⁸. FemDA tog upp denna fråga genom att systematiskt optimera de material och processer som används för beredning av mikroreaktorer/droppar. Flera anmärkningsvärda funktioner i de resulterande dropparna inkluderar hög enhetlighet (eller monodispersitet), stabilitet och biokompatibilitet på femtoliterskalan. Variationskoefficienten (CV) för droppvolymen är endast 3 % (utan vinjetteringskorrigering för mikroskopiska bilder), det minsta CV:t bland droppplattformar i världen, vilket säkerställer en mycket parallell och kvantitativ mätning. Femtoliterdroppen är stabil i minst 24 timmar utan korskontaminering bland droppar vid rumstemperatur, vilket är värdefullt för en tillförlitlig tidsförloppsmätning. När det gäller biokompatibilitet lyckades vi syntetisera olika proteiner från en enda kopia mall DNA i femtoliter droppen, som tidigare hade ansetts svårt eller ineffektiv^29,30. Det skulle vara värt att belysa varför vissa proteiner som kan syntetiseras i FemDA inte kan syntetiseras i andra droppsystem. FemDA var inte bara ett tekniskt framsteg, men också insåg en aldrig tidigare skådad kvantitativ mätning som kan korrelera proteinavkastningen (vilket återspeglas av fluorescensintensiteten hos droppen) till antalet mall-DNA-molekyler i varje droppe. Som ett resultat visade histogrammet av fluorescensintensiteten hos droppar från FemDA-baserade CFPS en diskret fördelning som fint kan monteras av en summa gaussiska fördelningar av lika topp-till-topp intervall. Dessutom var sannolikheten för förekomst av droppar som innehåller olika antal DNA-molekyler en perfekt passform till en Poisson fördelning³¹. Således kan de olika proteinavkastningen i varje droppe normaliseras baserat på den diskreta fördelningen. Denna kritiska funktion gör det möjligt för oss att skilja den enzymatiska aktivitetsinformationen från den skenbara intensiteten, som ännu inte har varit tillgänglig med andra mikroreaktorplattformar. Befintliga mikrofluidiska cell-/droppsorteringssystem är skickliga på helautomatisk sortering och bra på att koncentrera prover, men ibland kan bara produktionen av ett relativt brett eller långstjärtat histogram i den analytiska aspekten^32,33. Vårt mycket kvantitativa och biokompatibla FemDA-system sätter ett nytt riktmärke och en hög analytisk standard inom mikroreaktorutveckling.

De oljor och ytaktiva ämnen som kan användas för framställning av droppar är fortfarande mycket begränsade³⁴. Kombinationen av ASAHIKLIN AE-3000 och SURFLON S-386 etablerade i FemDA är en ny medlem av den växande arsenalen av det fysiokemiska gränssnittet mellan vattenfasen och oljefasen¹³. Det nya gränssnittet i FemDA är fysiskt stabil, kemiskt inert, och biologiskt kompatibel med komplexa transkription, översättning och post-translationell modifiering maskiner för många typer av proteiner¹³. Det skulle vara ganska attraktivt att hitta ett protein som inte kan syntetiseras i droplet inställningar istället. Dessutom är kostnadsbesparingen av reagenser tydligare i femtolterdroppsystemet än i nanoliter- och picoliterreaktorsystem^35,36. I synnerhet skulle det ofta finnas en stor död volym, som huvudsakligen orsakas av slangar eller externa leveranser, i mikrofluidiska droplet generation system men inte i vår FemDA. Matrisformatet gynnas också av upprepad och detaljerad mikroskopisk karakterisering (liknande så kallad höginnehållsanalys) för varje enskild^{reaktor 37}, snarare än bara en enda ögonblicksbild för ett snabbrörligt objekt. Femtoliterskalan möjliggjorde integration av över en miljon reaktorer på ett fingerstort område, medan samma antal nanoliterreaktorer (om sådana finns) kräver ett område med kvadratmeter, vilket utan tvekan skulle vara opraktiskt att tillverka eller använda ett sådant system.

Protocol

1. Mikrotillverkning av femtolitermikrokammarmatrissubstratet OBS: Utför följande mikrotillverkningsexperiment i ett renrum. Använd handskar och en renrumsdräkt innan du går in i renrummet. Rengöring av överknäckat glassubstrat Ställ täckglaset på ett omslagsglas glas glas glas. Sonikera täckglaset i 8 M natriumhydroxid (NaOH) i 15 min vid rumstemperatur (RT).VARNING: NaOH i höga koncentrationer är mycket farligt för hud och öga. Hantera den försiktigt ut…

Representative Results

Mikrofabriceringsprocessen består av substratrengöring, ytfunktionalisering, CYTOP-beläggning, fotolitografi, torretsning, fotoresiststriktion och slutrengöring. Viktigt är att det presenterade protokollet tillät fullständigt avlägsnande av den hydrofoba CYTOP-polymeren inuti mikrokammare figur 3A), vilket ger en mycket parallell hydrofil-i-hydrofoba struktur på ett standardtäcke glassubstrat. Med hjälp av oljetätningsprotokollet kontrollerades den enhetliga dimensionen av de res…

Discussion

Den mycket kvantitativa mätningen baserad på de mycket enhetliga, stabila och biokompatibla dropparna i FemDA möjliggjorde den diskreta fördelningen, det unika inslaget i vår studie som skiljer sig från andra. Vi optimerade och detaljerade systematiskt mikrotillverknings- och droppbildningsprocesserna i detta dokument. Det finns flera kritiska steg i det etablerade protokollet.

För det första bestämmer den enhetliga beläggningen av mycket trögflytande CYTOP-polymer på det rektangul…

Materials

(3-aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
1 mL syringe	Terumo	SS-01T
2-propanol	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope	Lasertec	OPTELICS HYBRID	Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe	Terumo	SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate	Thermo Fisher Scientific	D6567	Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use. Purity 99.8%.
Air blower	Hozan	Z-263
Aluminum block	BIO-BIK	AB-24M-02
Aluminum microtube stand	BIO-BIK	AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000	AGC	(Test sample)	Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper	Ozu	028208
Biopsy punch with plunger	Kai	BPP-10F
Cover glass	Matsunami Glass	No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness)	Size-customized.
Cover glass staining rack	Nakayama	803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper	Nippon Paper Crecia	C100-M
Cutting mat	GE Healthcare	WB100020
CYTOP	AGC	CTL-816AP
Deaeration mixer	Thinky	AR-100
Desktop cutter	Roland	STIKA SV-8
Developer	AZ Electronic Materials	AZ 300 MIF	AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape	Teraoka Seisakusho	7602 #25
Ethanol	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use. Purity 99.5%.
Fiji			Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter	Tokyo-IDEAL	MT-0100
Fomblin oil	Solvay	Y25, or Y25/6	Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate	AS ONE	TH-900
Injection needle	Terumo	NN-2270C	22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti-E	Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph	Synergy		Version: 4.5
Mask aligner	SUSS	MA-6	Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette	GILSON	E M250E	Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel	Microsoft		Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber	AS ONE	MVP-100MV
Nuclease-free water	NIPPON GENE	316-90101
Parafilm	Amcor	PM-996
PCR tube	NIPPON Genetics	FG-021D/SP
Petri dish	AS ONE	GD90-15	Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist	AZ Electronic Materials	AZ P4903	AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader	BioTek	POWERSCAN HT
Polyethelene gloves	AS ONE	6-896-02	Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit	New England Biolabs	E6800S or E6800L	For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system	Samco	RIE-10NR	Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor	New England Biolabs	M0314S
Scotch tape	3M	810-1-18D
Sodium hydroxide solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	194-09575	8 M concentration; danger.
Spin coater	Oshigane	SC-308
SURFLON S-386 surfactant	AGC	(Test sample)	Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer	Dow	Sylgard184	Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers	Ideal-tek	2WF.SA.1 2A
Ultrasonic cleaner	AS ONE	ASU-2M
Vacuum chuck	Oshigane	(Customized)	Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).