Protokollen presenterer utnyttelse av den kjemiske biopsitilnærmingen etterfulgt av omfattende metabolomisk og lipidmisk analyse for kvalitetsvurdering av nyretransplantater tildelt transplantasjon.
Nyretransplantasjon er en livreddende behandling for et stort antall personer med sluttstadium nyre dysfunksjon over hele verden. Prosedyren er forbundet med økt overlevelse og større kvalitet på pasientens liv sammenlignet med konvensjonell dialyse. Dessverre lider transplantasjonsteknologi av mangel på pålitelige metoder for organkvalitetsvurdering. Standard diagnostiske teknikker er begrenset til makroskopisk utseende inspeksjon eller invasiv vev biopsi, som ikke gir omfattende informasjon om graft. Den foreslåtte protokollen tar sikte på å innføre solid fase mikroektraksjon (SPME) som en ideell analytisk metode for omfattende metabolomikk og lipidomisk analyse av alle lavmolekylære forbindelser som finnes i nyrer tildelt transplantasjon. Den lille størrelsen på SPME-sonden muliggjør ytelse av en kjemisk biopsi, noe som muliggjør ekstraksjon av metabolitter direkte fra orgelet uten vevssamling. Den minste invasiviteten av metoden tillater gjennomføring av flere analyser over tid: rett etter organhøsting, under bevaring, og umiddelbart etter revaskularisering på mottakerens kropp. Det er hypotetisk at kombinasjonen av denne nye prøvetakingsmetoden med et høyoppløselig massespektrometer vil tillate diskriminering av et sett med karakteristiske forbindelser som kan tjene som biologiske markører for graftkvalitet og indikatorer for mulig utvikling av organdysfunksjon.
Ifølge USAs organinnkjøp og transplantasjonsnettverk var det 94 756 pasienter som ventet på nyretransplantasjoner i USA i 2019; mens i Europa i 2018 var dette tallet 10.791. Hvert tiende minutt blir noen lagt til den nasjonale transplantasjonventelisten i USA, og det er anslått at 20 mennesker dør hver dag og venter påen transplantasjon 1,2. Nyretransplantasjon er en livreddende behandling for et stort antall mennesker som lider med terminal nyredysfunksjon over hele verden. Prosedyren er forbundet med økt overlevelse og større livskvalitet sammenlignet med konvensjonell dialyse.
Transplantasjon står imidlertid overfor mange alvorlige problemer, som organmangel eller mangel på effektive verktøy for organkvalitetsvurdering. Standardprotokollene er begrenset til makroskopisk utseende inspeksjon eller invasiv vev biopsi, som ikke gir omfattende informasjon om kvaliteten på transplantatet. Mens en visuell vurdering gjør det mulig å identifisere svulster synlig for øyet, anatomiske abnormiteter eller omfattende skade på grafts, er denne tilnærmingen svært subjektiv, varierende i effektiviteten i henhold til observatørenes erfaring. Biopsi, derimot, kan gi verdifull informasjon om eksisterende nyresykdommer, og anses dermed å være en metode for objektiv og dokumentert verdi i å bestemme graft utfall. Biopsiprosedyren er imidlertid ikke fri for feil; det er risiko for potensielle komplikasjoner som blødning og ytterligere 4-5 timer med prøveforberedelse er nødvendig, noe som forlenger den kalde iskemiske tiden betydelig. Derfor, spesielt i Europa, er bruken av direkte vevsanalyse begrenset til utvidede kriterier donorer (ECD) og givere etter sirkulasjonsdød (DCD)3,4.
Metabolomics og lipidomics har nylig blitt anerkjent som lovende tilnærminger til å oppnå en bedre forståelse av endringene i biokjemiske veier som oppstår under organbevaring. Metabolomisk og lipidmisk profilering muliggjør overvåking av umiddelbare responser av systemet til plutselige miljøendringer knyttet til organfjerning med påfølgende konsekvenser: iskemi, oksidativt stress ellerinflammatoriske responser 5,,6,,7,,8. Nyrene er et organ som i stor grad er forbundet med metabolske prosesser, og dermed kan målinger av metabolitter og lipiderkonsentrasjoner tillate identifisering av potensielle organkvalitet biomarkører og muliggjøre bedre spådommer om graft utfall.
Gitt de ovennevnte komplikasjonene og begrensningene forbundet med dagens organkvalitetsvurderingsmetoder, er det nødvendig med en mindre invasiv diagnostisk løsning for rask og kompleks organkvalitetsvurdering. Solid fase mikroektraksjon (SPME) overholder disse kravene som en minimal invasiv analytisk metode som muliggjør dekning av et bredt spekter av metabolitter og lipider. Teknikken er basert på innsetting av en tynn (~ 200 μm), biokompatibel, titan-nikkellegeringssonde dekket med en selektiv ekstraksjonsfase i det undersøkte organet i kort tid. Det bør understrekes at SPME forhindrer proteinekstraksjon, og dermed muliggjør metabolismehemming allerede på prøvetakingsstadiet, noe som er en betydelig fordel over alternative metoder. Videre gjør miniatyrisering av enheten mulighet for utførelse av repeterende og samtidige analyser av få strukturer iorgelet 9,10,11.
Evaluering av organkvalitet er fortsatt en stor utfordring for leger, som må ta raske informerte beslutninger om hvorvidt et gitt organ er levedyktig for transplantasjon eller om det må kastes. Flere faktorer, som donoralder, iskemi varighet og infeksjoner og inflammatoriske prosesser, kan påvirke det langsiktige graft-resultatet. Mens ulike metoder er utviklet til dags dato for å diagnostisere nyre allograft funksjon, histopatologisk inspeksjon forblir gullstandarden i densaks skyld 3,4,12. Selv om biopsiprosedyren kan gi betydelig informasjon om eksisterende donorsykdom og vaskulære endringer, er den ikke fri for feil. Prøvetakingsfeil knyttet til interobservervariabilitet og utvalg av utilstrekkelige glomeruli for omfattende informasjon om organfunksjon er fortsatt typiske bekymringer i denne forbindelse. Videre gir prøveforberedelse noen problemer som en ufullstendig vurdering av transplantatet i tilfelle frosne seksjoner, og forlengelse av prosedyretid for parafinseksjon. Imidlertid er den økte risikoen for blødning, som kan virke akutt som mikroskopisk eller grov hematuri, den store livstruende komplikasjonen forbundet med biopsiprosedyren. Av denne grunn er antall tillatte biopsier strengt begrenset i transplantasjonsprosedyrer, en faktor som hindrer fangst av dynamiske endringer og tidsserieanalyser via denne metoden12,,13,,14. Fordelene med en histologisk analyse må veies mot risikoen forbundet med metodikken. Verdien av histologiske funn er ubestridelig, men de forklarer ikke de molekylære mekanismene i avvikene.
Metabolomics og lipidomics er de yngste domenene i “-omics” vitenskapelig familie. Det komplette settet med lavmolekylære (<1200 Da) menneskelige metabolitter og lipider som er koblet til i et metabolsk nettverk, er definert som en human metabolom. Genomet forblir relativt konstant gjennom hele levetiden, med små modifikasjoner forårsaket av mutasjoner som forekommer sjelden. Metabolomen er et produkt av genuttrykk, som er svært følsom for endringer i alle biologiske prosesser samt miljøfaktorer. Den dynamiske naturen til metabolitter og lipider gjør dem perfekte indikatorer på dagens organtilstand7,8,15,16. SPME-metoden som foreslås i ovennevnte protokoll, muliggjør påvisning av endringer som skjer i orgelet under bevaringen, fra organfjerning fra donorens kropp til revaskularisering hos mottakeren. Sondens lille diameter (~200 μm) gir minimal invasivitet og gir mulighet for flere prøvetakinger fra samme organ uten å forårsake skade på vevet. Gjennomføre studier ved hjelp av nyre, som den hyppigst transplanterte organ, gir en bedre forståelse og videre karakterisering av metabolske veier ansvarlig for å redusere kvaliteten og funksjonen av grafts. Muligheten for overvåking modifikasjoner over tid absolutt er en viktig fordel med teknikken i forhold til konvensjonelle invasive metoder som biopsi. Den presenterte analysen identifiserte endrede konsentrasjoner av ulike grupper av lipider og metabolitter, spesielt av essensielle aminosyrer, puriner, purinkjerner og glyserofosfolipider. Disse resultatene er i samsvar med tidligere vev analyserapporter 5,6,17,18,19,20. Til dags dato har de fleste vitenskapelige rapporter som bruker metabolomikk eller lipidomikk for å forklare prosessersom induserer komplikasjoneretter transplantasjon eller iskemi / reperfusjonsskade (IRI) fenomener vært begrenset til analyse av biofluider 21,22,23.
Hver klinisk applikasjon krever optimalisering av prøvetakingsprotokollen for å sikre at ytelsen til den analytiske metoden oppfyller forventede kriterier. I denne forbindelse er fordelen med å utnytte SPME muligheten for å justere forholdene for ulike eksperimentelle design. Utvalget av tilgjengelige ekstraksjonsfaser gir et bredt spekter av ekstraherte metabolitter med diversifiserte polariteter. Samtidig kan dette betraktes som en begrensning av metoden på grunn av det faktum at hver sorbent gir selektivitet mot bestemte funksjoner og ikke trekker ut alle forbindelser som finnes i prøvematrisen. Det bør bemerkes at SPME belegg ekstrakt bare via frie molekyler, og rett og slett ikke samhandle med en bundet brøkdel av analyten. Biokompatibiliteten til belegget introduserer ikke toksisitet for vevet mens du begrenser utvinningen av store molekyler som proteiner; Som en konsekvens hemmes de enzymatiske prosessene allerede på prøvetakingsstadiet, og tilstedeværelsen av gjenstander minimeres, noe som er en stor fordel over alternative prøvetakingsmetoder. Lengden på belegget påvirker effektiviteten av ekstraksjon (det vil vil vil at lengden på belegget angir overflatearealet og ekstraksjonsfasevolumet); dermed gir lengre belegg høyere gjenopprettinger. På den annen side gir kortere belegg høyere romlig oppløsning. For pålitelige resultater er det avgjørende å senke sonden til nøyaktig samme dybde av nyrecortex. Innsetting for dyp forårsaker risikoen for å komme inn i nyre medulla. Tidspunktet for utvinningen er også proporsjonal med utvinningseffektiviteten. Derfor er valg av optimal ekstraksjonstid et av de mest kritiske trinnene i SPME-metodeutvikling. Nøyaktigheten av tidsmåling gir høyest repeterbarhet. I biologiske anvendelser som den som diskuteres, er det alltid et kompromiss mellom følsomheten og repeterbarheten til den analytiske protokollen og restriksjonene i den medisinske prosedyren. Mens likevekt ekstraksjon gir den høyeste følsomheten, av sikkerhetsmessige grunner, pre-likevekt forhold brukes ofte i slike applikasjoner, som utvinning tid bør ikke påvirke den totale varigheten av operasjonen. Effektiviteten av avsorpsjon bestemmes av tidspunktet for prosessen og sammensetningen av avsorpsjonsløsemiddelet, som skal være kompatibel med den mobile fasen som brukes til kromatografisk separasjon9,,10,,11.
Et av de viktigste kravene til diagnostisk instrumentering som brukes til intrakirurgiske vurderinger er analysetid. Nåværende forsøk blir gjort for å utvikle et raskt verktøy for in vivo SPME ekstraksjon koblet direkte til et massespektrometer via mikrofluidisk åpent grensesnitt (MOI)24 eller belagt bladspray (CBS)25. Slike tilnærminger ville tillate offentliggjøring av analytiske resultater i reell eller nær sanntid. Bruken av slike metoder for pre-intervensjon analyser av metabolske og lipidomiske profiler kan forbedre beslutningsprosessen under transplantasjonprosedyrer, slik at best mulig personlig tilnærming og rask respons i tilfelle organsvikt.
Som et sammendrag er det hypotetisk at den foreslåtte protokollen vil muliggjøre oppnåelse av fulle metabolske og lipidomiske profiler av nyretransplantater, som igjen vil gi en omfattende vurdering av organkvalitet og karakterisering av prosessene som er ansvarlige for iskemi-reperfusjonsskade. Nyheten om prosjektet inkluderer utnyttelse av solid-fase mikrokstraksjon (SPME), som tilbyr lav invasiv prøvetaking av levende systemer, i kombinasjon med en av de mest innovative teknologiene som er tilgjengelige for metabolomics og lipidomics analyse (f.eks Orbitrap høy oppløsning massespektrometer). SPME kombinerer prøveinnsamling, ekstraksjon og slukking av metabolitter i ett trinn, noe som gjør det til et perfekt verktøy for rask analyse. Det forventes at denne protokollen vil bidra til å svare på spørsmål knyttet til hvilke pre-transplantasjon forhold i nyrene er ansvarlig for forsinket organfunksjon eller dets dysfunksjoner etter transplantasjon, samt hvordan graft bevaring protokollen påvirker biokjemi av orgelet. Slik kunnskap ville ikke bare ha betydelig innvirkning på forebygging av mulige komplikasjoner knyttet til transplantasjon, men kan bidra til å forbedre dagens pode bevaring protokoller, minimere tap av levedyktig transplantasjon vev samt tap av liv. Den foreslåtte løsningen vil åpne døren for videre undersøkelser på dette feltet, inkludert validering av spesifikke potensielle biomarkører og forbedring av terapeutiske utfall i transplantasjon.
The authors have nothing to disclose.
Studien ble støttet av stipend Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 fra National Science Centre. Forfatterne ønsker å anerkjenne MilliporeSigma, en bedrift av Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland for å gi SPME-enheter. Life Science-virksomheten til Merck opererer som MilliporeSigma i USA og Canada. Også forfatterne ønsker å takke Thermo Fisher Scientific for tilgangen til Q-Exactive Focus orbitrap massespektrometer. Forfatterne vil gjerne takke Dr. Aleksandra Woderska-Jasińska og personellet ved Institutt for transplantologi og generell kirurgi i Bydgoszcz for deres vennlige hjelp i prosjektet. BB vil takke prof. Janusz Pawliszyn for muligheten for prøvesamling på Toronto General Hospital under sitt opphold ved University of Waterloo.
Acetic acid | Merck | 5330010050 | Mobile phase additive |
Acetonitrile | Alchem | 696-34967-4X2.5L | HPLC solvent |
Ammonium acetate | Merck | 5330040050 | Mobile phase additive |
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER | Benchmark Scientific | BV1010 | Vortex mixer |
Caps | Perlan Technologies | 5183-2076 | Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK |
Chloroform | Merck | 1024441000 | |
Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm | Merck | 567570-U | HPLC guard column |
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC column |
Formic acid | Alchem | 497-94318-50ML | Mobile phase additive |
Glass vials | Perlan Technologies | 5182-0714 | |
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC column |
HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-AJ0-8328 | HPLC guard column |
Isopropanol | Alchem | 231-AL03262500 | HPLC solvent |
Methanol | Alchem | 696-34966-4X2.5L | HPLC solvent |
Nano-pure water | Merck | 1037281002 | HPLC solvent |
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | Q Exactive Focus | Mass Spectrometer |
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC column |
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Merck | 1504360001 | HPLC guard column |
SPME LC fiber probes, mixed mode | Supelco | prototype fibers | |
UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | UltiMate 3000 | HPLC system |
Vial inserts (deactivated) | Perlan Technologies | 5181-8872 | |
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC column |
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm | Waters | 186007811 | HPLC guard column |