Conjugués de BODIPY conventionnels pour la microscopie à super-résolution à cellules vives et le suivi à molécule unique

Santosh Adhikari; Chiranjib Banerjee; Joe Moscatelli; Elias M. Puchner

doi:10.3791/60950

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Article de méthode

Conjugués de BODIPY conventionnels pour la microscopie à super-résolution à cellules vives et le suivi à molécule unique

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DOI :

10.3791/60950

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8 juin 2020

Santosh Adhikari¹ , Chiranjib Banerjee^*¹ , Joe Moscatelli^*¹^,² , Elias M. Puchner¹

¹School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), ²Middlebury College

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les conjugués conventionnels de BODIPY peuvent être employés pour la microscopie de localisation à cellule unique vivante (SMLM) par l’exploitation de leurs dimers terrestres de formation transitoire et à miettes rouges. Nous présentons un protocole SMLM optimisé pour suivre et résoudre les lipides neutres subcellulaires et les acides gras dans les cellules vivantes de mammifères et de levure à l’échelle de longueur nanoscopique.

Résumé

Les techniques de microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) surmontent la limite de diffraction optique de la microscopie conventionnelle de fluorescence et peuvent résoudre les structures intracellulaires et la dynamique des biomolécules avec une précision de 20 nm. Une condition préalable pour SMLM sont les fluorophores qui passent d’un état sombre à un état fluorescent afin d’éviter le chevauchement spatio-temporel de leurs fonctions de propagation de points dans chacun des milliers de cadres d’acquisition de données. Les BODIPY sont des colorants bien établis avec de nombreux conjugués utilisés dans la microscopie conventionnelle. La formation transitoire de dimers d’état au sol BODIPY (D_II)à l’origine d’une seule molécule brillante permet une microscopie de localisation à une seule molécule (SMLM). Ici, nous présentons un protocole simple mais polyvalent pour SMLM avec des conjugués conventionnels BODIPY dans la levure vivante et les cellules de mammifères. Cette procédure peut être utilisée pour acquérir des images super-résolution et pour suivre les états seuls de BODIPY-D_II pour extraire des informations spatio-temporelles des conjugués de BODIPY. Nous appliquons cette procédure pour résoudre les gouttelettes lipidiques (LD), les acides gras et les lysosomes dans la levure vivante et les cellules de mammifères à l’échelle de longueur nanoscopique. En outre, nous démontrons la capacité d’imagerie multi-couleurs avec des colorants BODIPY lorsqu’ils sont utilisés en conjonction avec d’autres sondes fluorescentes. Nos résultats représentatifs montrent la répartition spatiale différentielle et la mobilité des acides gras BODIPY et des lipides neutres dans la levure dans des conditions nourries et jeûnées. Ce protocole optimisé pour SMLM peut être utilisé avec des centaines de conjugués BODIPY disponibles dans le commerce et est une ressource utile pour étudier les processus biologiques à l’échelle nanométrique bien au-delà des applications de ce travail.

Introduction

Les techniques de microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) telles que la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et la microscopie localisée activée par photo (PALM) sont apparues comme des méthodes pour générer des images super-résolution avec des informations au-delà de la limite de diffraction optique d’Abbe¹^,² et pour suivre la dynamique des biomolécules^{uniques 3}^,⁴. L’une des exigences pour les sondes compatibles avec SMLM est la capacité de contrôler le nombre de fluorophores actifs à tout moment pour éviter le cheva....