En Neurite Outgrowth Assay og Neurotoxicity Vurdering med Human Neural Progenitor Cell-Derived Neuroner
Summary
Den fremlagte protokol beskriver en metode til en neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering af små molekyle forbindelser.
Abstract
Neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering er to store undersøgelser, der kan udføres ved hjælp af den præsenterede metode heri. Denne protokol giver pålidelig analyse af neuronal morfologi sammen med kvantitative målinger af modifikationer på neurite længde og synaptisk protein lokalisering og overflod ved behandling med små molekyle forbindelser. Ud over anvendelsen af den præsenterede metode i neurite udvækstundersøgelser kan der foretages en neurotoksicitetsvurdering for at vurdere, skelne og rangordne kommercielle kemiske forbindelser baseret på deres potentielle udviklingsmæssige neurotoksicitetseffekt.
Selv om cellelinjer er i dag udbredt i sammensatte screening assays i neurovidenskab, de ofte adskiller sig genetisk og fænotypisk fra deres væv oprindelse. Primære celler, på den anden side, opretholde vigtige markører og funktioner observeret in vivo. Derfor, på grund af oversættelsen potentiale og fysiologiske relevans, at disse celler kunne tilbyde neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering kan betydeligt drage fordel af at bruge humane neurale progenitor celler (hNPC’ er) som den primære menneskelige celle model.
Den præsenterede metode heri kan bruges til at screene for evne til forbindelser til at fremkalde neurite udvækst og neurotoksicitet ved at drage fordel af den menneskelige neurale stamfader celle-afledte neuroner, en celle model tæt repræsenterer den menneskelige biologi.
Introduction
Neurite vækst er en proces, der er grundlæggende for dannelsen af det neuronale netværk og nerve regenerering1,2. Efter en skade, neurite udvækst spiller en central rolle i regenerering af nervesystemet. Neurite udvækst er også et vigtigt element i den ekstracellulære signalering i inducerende neuronal regenerative aktiviteter for at forbedre resultaterne for neurodegenerative lidelser og neuronal skade3,,4,5,6.
Ved at opretholde deres differentieringspotentiale i produktionen af forskellige neurale slægter, menneskelige neurale stamceller (hNPC’er) kunne give en model system for undersøgelser af centralnervesystemet (CNS) funktion og udvikling7,8,9. Høj translationel potentiale og fysiologisk relevans af hNPC’er som en primær human celle model giver en betydelig fordel i neurite udvækst-relaterede drug discovery screenings. Vedligeholdelse og skalering af primærcellemodellerne til analyser med høj kapacitet kan dog være tidskrævende og arbejdskrævende10,11,12,13.
Ud over anvendelsen af den præsenterede metode i neurite udvækstundersøgelser er neurotoksicitetsvurdering en anden anvendelse ved hjælp af hNPC-afledte neuroner. Der er tusindvis af kommercielle kemiske forbindelser, der enten ikke undersøges eller med dårligt forstået neurotoksicitet potentiale. Derfor, mere pålidelige og effektive screening eksperimenter til at vurdere, skelne, og rang forbindelser baseret på deres potentiale til at fremkalde udviklingsmæssige neurotoksicitet er i høj efterspørgsel14. Stigningen i prævalens og forekomst af neurologiske lidelser sammen med den overflod af uprøvede forbindelser i miljøet nødvendiggør udvikling af mere troværdige og effektive eksperimenter til at identificere farlige miljøforbindelser, der kan udgøre neurotoksicitet15.
Den præsenterede metode heri kan udnyttes til at screene for evne til forbindelser til at fremkalde neurite udvækst og neurotoksicitet ved at drage fordel af den menneskelige neurale stamfader celle-afledte neuroner, en celle model tæt repræsenterer den menneskelige biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol er en af de få offentliggjorte papirer, der beskriver testen for neurite længde ved behandling med testforbindelser. Desuden beskriver vi, hvordan man bruger hNPC’er til en neurite outgrowth assay og neurotoxicity vurdering. Ved at udnytte denne neurite outgrowth assay og neurotoxicity vurdering på hNPCs-afledte neuroner, det neurogene potentiale af en kategori af epigenetiske små-molekyle forbindelser, HDAC hæmmere, i inducerende neurite udvækst er påvist22. Endvidere, i et …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev finansieret af NIMAD forskningstilskud (940714) tildelt MAF.
Materials
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer’s disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer’s Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
