Um modelo imunológico para transplante heterotópico de células cardíacas e cardíacas em ratos
Summary
Descrevemos um modelo de transplante de coração abdominal heterotópico em ratos, implicando modificações nas estratégias atuais, que levam a uma abordagem cirúrgica simplificada. Além disso, descrevemos um novo modelo de rejeição pela injeção in-ear de células musculares cardíacas vitais, permitindo novas análises imunológicas de transplante em ratos.
Abstract
O transplante de coração heterotópico em ratos tem sido um modelo comumente utilizado para diversos estudos imunológicos há mais de 50 anos. Várias modificações foram relatadas desde a primeira descrição em 1964. Após 30 anos realizando transplante de coração heterotópico em ratos, desenvolvemos uma abordagem cirúrgica simplificada, que pode ser facilmente ensinada e realizada sem maior treinamento cirúrgico ou antecedentes.
Após a dissecção da aorta ascendente e da artéria pulmonar e da ligadura de veias superiores e inferiores caval e pulmonar, o coração do doador é colhido e posteriormente perfundido com solução salina gelada suplementada com heparina. Após a fixação e incisamento dos vasos abdominais receptores, o doador ascendente de aorta e artéria pulmonar são anastomosados para a aorta abdominal receptora e veia cava inferior, respectivamente, usando suturas contínuas de corrida.
Dependendo de diferentes combinações doador-receptor, este modelo permite análises de rejeição aguda ou crônica de aloenxertos. O significado imunológico deste modelo é ainda mais aprimorado por uma nova abordagem da injeção intra-auricular de células musculares cardíacas vitais e posterior análise do tecido linfático cervical drenante.
Introduction
O transplante de coração heterotópico é um modelo experimental frequentemente utilizado para diferentes investigações sobre tolerância ao transplante, rejeição aguda e crônica de aloenxerto, lesão isquemia-reperfusão, perfusão de máquinas ou remodelagem cardíaca. Entre outras vantagens, a função do enxerto pode ser monitorada de forma não invasiva por palpação e a falha do enxerto não leva a um prejuízo vital do receptor em contraste com outros órgãos, como rins ou fígados.
Em 1964, Abbott et al. descreveram inicialmente transplante de coração abdominal heterotópico em ratos1. Mais tarde, em 1966, a técnica de ponta a ponta para anastomoses foi descrita por Tomita et al.2. As bases para o modelo atualmente usado foram relatadas por Ono e Lindsey em 19693. Durante as últimas décadas, várias modificações foram publicadas para criar diferentes tipos de enxertos cardíacos ventriculares esquerdos descarregados, parcialmente carregados ou carregados, incluindo transplante heterotópico heterotópico coração-pulmão4,5,6. Para análises imunológicas, é mais comumente realizado um transplante de enxerto cardíaco carregado sem volume. Neste caso, o fluxo sanguíneo entra retrógradamente na aorta ascendente do doador e, posteriormente, nas artérias coronárias. A drenagem venosa ocorre ao longo do seio coronário no átrio direito e ventrículo(Figura 1A-B). Portanto, o ventrículo esquerdo está excluído do fluxo sanguíneo, além de quantidades marginais de sangue das veias tesésias. Isso também o torna um modelo útil para o estudo dos mecanismos fisiopatológicos durante a terapia do dispositivo de assistência ventricular esquerda7.
O transplante de coração heterotópico tem sido realizado em várias espécies, incluindo camundongos, coelhos, porcos e tem sido até usado como um dispositivo de assistência uniou ou biventricular em humanos8,,9,,10,11. O rato ainda representa um animal experimental popular para modelos de transplante, especialmente porque os tempos de sobrevivência do enxerto para diferentes combinações de cepas de ratos foram bem definidos no passado e um grande número de reagentes imunológicos são acessíveis12,13. Ao contrário dos camundongos, os ratos são maiores fazendo cirurgia e acesso ao tecido linfático para análises imunológicas mais viável12. Além disso, a introdução de tecnologias comerciais de clonagem em ratos nos últimos anos provavelmente levará a um interesse recorrente em modelos experimentais de ratos14.
Em geral, enxertos cardíacos heterotópicos podem ser anexados aos vasos receptores, seja realizando anastomose cervical ou abdominal. No entanto, alguns estudos sugerem que uma anastomose femoral facilita o melhor monitoramento devido ao melhor acesso à palpação manual ou ecocardiografia transfemoral e, portanto, permite uma detecção mais precisa da falha do enxerto15,16.
Mostrou-se que não há diferença quanto ao tempo de operação, taxa de complicações, desfecho e tempo de sobrevivência do enxerto entre ambas as técnicas de anastomose17. Claramente, a disponibilidade de um número suficiente de linfonodos drenantes deve ser mencionada como um benefício da anastomose cervical; no entanto, períodos de treinamento mais longos são necessários. Em contraste, a anastomose abdominal é menos complicada e igualmente valiosa para investigações imunológicas, especialmente quando combinada com resultados de um novo método de injeção intra-auricular de células musculares cardíacas alogênicas e linfadenectomia cervical subseqüente. Uma combinação de ambos os modelos oferece um amplo espectro de análises imunológicas pós-intervencionistas.
O protocolo a seguir refere-se à operação em pares de cirurgiões, a fim de reduzir o tempo de isquemia. No entanto, todos os experimentos podem ser realizados por uma única pessoa. A configuração de instrumentos e materiais para explantação e implantação de coração é exibida na Figura 2A-B.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método anteriormente descrito de transplante cardíaco heterotópico em ratos baseia-se principalmente na descrição de Ono e Lindsey em 19693. Desde então, várias modificações foram introduzidas em várias espécies levando a uma ampla diversidade deste modelo. Combinando várias dessas modificações e introduzindo nossa própria experiência resultante de mais de 30 anos realizando transplantes de coração heterotópicos em laboratório, criamos uma abordagem cirúrgica viável, que n?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer a Britta Trautewig, Corinna Löbbert e Ingrid Meder pelo comprometimento.
Materials
| Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) | Summit Anesthesia Solutions | No Catalog Number available | |
| Cannula (27 G) | BD Microlance | 302200 | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl 50 mg/mL | |
| Cellstar Tubes (15 mL) | GreinerBioOne | 188271 | |
| Cell strainer (40 µm) | BD Falcon | 2271680 | |
| Collagenase Type CLSII | Biochrome | C2-22 | |
| Compresses 5×5 cm | Fuhrmann | 31501 | |
| Compresses 7.5×7.5 cm | Fuhrmann | 31505 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf | 1032128 | |
| Dexpathenol (5 %) | Bayer | "Bepanthen" | |
| DPBS BioWhittaker | Lonza | 17-512F | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD557R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD313R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD35 | |
| Heating mat | Gaymar Industries | "T/Pump" | |
| Hemostatic gauze | Ethicon | Tabotamp | |
| Heparin-Natrium 25 000 I.E. | Ratiopharm | No Catalog Number available | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-pored sieve (stainless steel) | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| Lidocaine | Astra Zeneca | 2 % Xylocain | |
| Metamizol-Natrium | Ratiopharma | Novaminsulfon 500 mg/mL | |
| Micro forceps | B. Braun | Aesculap BD3361 | |
| Micro needle holder | Codman, Johnson & Johnson Medical | Codmann 80-2003 | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap BD336R | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap FD241R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FD101R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FM471R | |
| Needle holder | B. Braun | Aesculap BM221R | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) | PAA | P11-010 | |
| Peripheral venous catheter (18 G) | B. Braun | 4268334B | |
| Peripheral venous catheter (22 G) | B. Braun | 4268091B | |
| Probe pointed scissors | B. Braun | Aesculap BC030R | |
| Retractors | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| RPMI culture medium | Lonza | BE12-702F | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Baxter | No Catalog Number available | |
| Scissors | B. Braun | Aesculap BC414 | |
| Surgical microscope | Carl-Zeiss | OPMI-MDM | |
| Sutures (anastomoses) | Catgut | Mariderm 8-0 monofil | |
| Sutures (ligature) | Resorba | Silk 5-0 polyfil | |
| Sutures (skin, fascia) | Ethicon | Mersilene 3-0 | |
| Syringe (1 mL) | B. Braun | 9166017V | |
| Syringe (10 mL) | B. Braun | 4606108V | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4606205V | |
| Vascular clamp | B. Braun | Aesculap FB708R |
References
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