लाइव, बरकरार ऊतक में सेल डिवीजन के विश्लेषण के लिए ड्रोसोफिला लार्वा और पुपल टेस्ट की तैयारी
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य ड्रोसोफिला मेओइटिक शुक्राणुओं का उपयोग करके लाइव और फिक्स्ड सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा अक्षुण्ण ऊतकों में सेल डिवीजन का विश्लेषण करना है। प्रोटोकॉल यह दर्शाता है कि ड्रोसोफिला लार्वा और शुरुआती पिल्ले से पूरे, बरकरार टेस्ट को कैसे अलग किया जाए, और माइक्रोस्कोपी के लिए उन्हें कैसे संसाधित और माउंट करें।
Abstract
जीवित, अक्षुण्ण ऊतकों और अंगों में विभाजित कोशिकाओं का प्रायोगिक विश्लेषण हमारी समझ के लिए आवश्यक है कि सेल डिवीजन विकास, ऊतक होमोस्टोसिस और रोग प्रक्रियाओं के साथ कैसे एकीकृत करता है। मेयोसिस से गुजर रहे ड्रोसोफिला शुक्राणुइस विश्लेषण के लिए आदर्श हैं क्योंकि (1) शुक्राणुओं से युक्त पूरे ड्रोसोफिला टेस्ट माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार करना अपेक्षाकृत आसान है, (2) शुक्राणुओं का बड़ा आकार उन्हें उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल बनाता है, और (3) शक्तिशाली ड्रोसोफिला आनुवंशिक उपकरण ों को वीवो विश्लेषण में एकीकृत किया जा सकता है। यहां, हम ड्रोसोफिला तीसरे इंस्टार लार्वा और शुरुआती पिल्ले से पूरे टेस्ट की तैयारी के लिए एक आसानी से सुलभ प्रोटोकॉल पेश करते हैं। हम वर्णन करते हैं कि तैयार पूरे टेस्ट में मेओटिक शुक्राणुओं की पहचान कैसे करें और उन्हें समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा कैसे छवि दी जाए। निर्धारण और इम्यूनोस्टेनिंग पूरे टेस्टेस के लिए प्रोटोकॉल भी प्रदान किए जाते हैं। लार्वा टेस्ट के उपयोग के उपलब्ध प्रोटोकॉल पर कई फायदे हैं जो शुक्राणुओं के विश्लेषण के लिए वयस्क टेस्ट का उपयोग करते हैं। सबसे महत्वपूर्ण बात, लार्वा टेस्ट वयस्क टेस्ट की तुलना में कोशिकाओं के साथ छोटे और कम भीड़ वाले होते हैं, और यह शुक्राणुओं के उच्च संकल्प इमेजिंग की बहुत सुविधा प्रदान करता है। इन फायदों और प्रोटोकॉल के अनुप्रयोगों को प्रदर्शित करने के लिए, हम समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि वाले एक शुक्राणुमें सेल डिवीजन के दौरान स्पिंडल माइक्रोट्यूबल के संबंध में एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम के पुनर्वितरण को दिखाने वाले परिणाम प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंटी टैग प्रोटीन या ऑर्गेनेल मार्कर, साथ ही जीन म्यूटेशन और अन्य आनुवंशिक उपकरणों की किसी भी संख्या की अभिव्यक्ति के साथ जोड़ा जा सकता है, जिससे पूरे ऊतकों और अंगों के शारीरिक संदर्भ में सेल डिवीजन तंत्र के विश्लेषण के लिए यह दृष्टिकोण विशेष रूप से शक्तिशाली हो जाता है।
Introduction
सेल डिवीजन अक्सर संस्कृति1में उगाया सेल लाइनों का उपयोग कर अध्ययन किया जाता है । जब तक हम अमूल्य अंतर्दृष्टि और इन अध्ययनों से मौलिक तंत्र की समझ का खजाना प्राप्त किया है2,संस्कृति में उगाया कोशिकाओं को पूरी तरह से सेल विभाजन के शरीर विज्ञान संक्षिप्त नहीं कर सकते के रूप में यह बरकरार, रहने वाले ऊतकों में होता है । उदाहरण के लिए, अक्षुण्ण ऊतकों और अंगों में, कोशिकाओं को सही जगह पर और सही समय पर विभाजित करना चाहिए ताकि संतान कोशिकाएं ऊतक के भीतर ठीक से स्थित हों, ताकि वे उचित विभेदन या कार्यात्मक कार्यक्रमों से गुजर सकें, और ताकि कोशिका प्रसार ऊतक विकास या होमोस्टोसिस3के साथ ठीक से समन्वित हो। दूसरी ओर संस्कृति में उगाई जाने वाली कोशिकाओं के लिए, सेल डिवीजन आम तौर पर संस्कृति माध्यम4में विकास कारकों द्वारा विनियमित होता है, और इस प्रकार हम इन कोशिकाओं से नहीं सीख सकते कि ऊतक वास्तुकला या विकासात्मक सिग्नलिंग जैसे वीवो पर्यावरणीय कारकों में विभाजन प्रक्रिया को कैसे प्रभावित करता है। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सेल डिवीजन, जैसे वाघेला और U2OS कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली कई सेल लाइनें मेटास्टैटिक ट्यूमर5से प्राप्त की गई थीं। इसलिए, इन कैंसर कोशिकाओं के बुनियादी शरीर विज्ञान के कई पहलुओं, जैसे सेल साइकिल नियामक तंत्र और गुणसूत्र स्थिरता, स्वस्थ कोशिकाओं की तुलना में बदल दिया गया है । सेल डिवीजन शरीर विज्ञान की पूरी समझ, इसलिए, शारीरिक नियामक तंत्र और ऊतक वास्तुकला को संरक्षित करने वाले वीवो वातावरण में, अपने मूल में विभाजित कोशिकाओं का अध्ययन करने की हमारी क्षमता पर निर्भर करता है।
यह समझने में प्रगति कि कोशिका विभाजन बरकरार ऊतकों के भीतर कैसे संचालित होता है और अंग वीवो या पूर्व वीवो विश्लेषण में निहित कठिनाइयों से बाधित होते हैं। सबसे पहले, बड़े अंगों या मोटी ऊतकों के भीतर सूक्ष्म विश्लेषण के लिए विभाजित कोशिकाओं तक पहुंचना मुश्किल या असंभव हो सकता है। दूसरा, यह अक्सर भविष्यवाणी करना मुश्किल होता है कि विवो में व्यक्तिगत कोशिकाएं कब विभाजित होंगी। तीसरा, पूर्व वीवो संस्कृति के दौरान ऊतक शरीर विज्ञान तेजी से खराब हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर शुक्राणुओं के लाइव और निश्चित विश्लेषण के लिए आसानी से सुलभ तरीकों का वर्णन करते हैं क्योंकि वे पूरी तरह से बरकरार टेस्ट के भीतर मेओटिक सेल डिवीजनों से गुजरते हैं। ये कोशिकाएं लाइव, पूर्व वीवो विश्लेषण के लिए आदर्श हैं क्योंकि वे मानक ऑप्टिकल तरीकों जैसे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ आसानी से सुलभ हैं, वे उम्मीद के मुताबिक समय और स्थानों पर विभाजित होते हैं, और अक्षुण्ण टेस्ट पूर्व वीवो संस्कृति में लगभग 24 घंटे तक बनाए रखा जा सकता है। इसके अलावा, ड्रोसोफिला शुक्राणु बड़े दौर की कोशिकाएं (व्यास में लगभग 20-30 माइक्रोन) होती हैं जो विभाजित होने पर आकार नहीं बदलती हैं, जिससे उन्हें उच्च संकल्प के लिए आदर्श बनादिया जाता है, सेलुलर घटकों की समय-चूक इमेजिंग जैसे धुरी उपकरण और साइटोप्लाज्मिक ऑर्गेनेल्स। यद्यपि इन कोशिकाओं को माइटोसिस के विपरीत मेयोसिस से गुजरना पड़ता है, लेकिन इन दो सेल डिवीजन तंत्र6के बीच कई आवश्यक सेल डिवीजन प्रक्रियाएं बहुत समान हैं। शक्तिशाली ड्रोसोफिला आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त,इन फायदों ने ड्रोसोफिला शुक्राणुओं को स्पिंडल गठन और विनियमन, साइटोकिनेसिस, और ऑर्गेनेल रीमॉडलिंग और विभाजन,7,8,89,10,,11सहित आवश्यक सेल डिवीजन प्रक्रियाओं के पूर्व वीवो विश्लेषण के लिए एक बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया मॉडल बनाया है।
शुक्राणुओं की कोशिकाएं होती हैं जो शुक्राणुजनन के मेयोटिक चरण में होती हैं। ड्रोसोफिलामें शुक्राणुजनन की शुरुआत जर्मलाइन स्टेम कोशिकाओं के एक समूह से होती है जो एक छोटे से क्षेत्र में स्थित होते हैं या टेस्टिस12,13के एक ध्रुव पर “हब” होते हैं। ये कोशिकाएं एक असममित माइटोसिस से विभाजित होती हैं, जिससे एक अलग शुक्राणुओं को जन्म मिलता है। इसके बाद स्पर्माटोगोनिया को 16 कोशिकाओं के समूह का उत्पादन करने के लिए चार सिंक्रोनस माइटोस से गुजरना पड़ता है जो एक ही पुटी के भीतर निकटता से जुड़े रहते हैं। इस स्तर पर, कोशिकाएं माइटोटिक से एक मेयोटिक सेल चक्र में संक्रमण करती हैं और इसे शुक्राणुओं के रूप में जाना जाता है। शुक्राणु कोशिका चक्र के विस्तारित जी-2 चरण में लगभग दो से तीन दिन बिताते हैं, जिसके दौरान वे नाटकीय रूप से बढ़ते हैं और दो मेयोटिक डिवीजनों और बाद के शुक्राणुजनन13,,14की तैयारी में साइटोलॉजिकल परिवर्तनों से गुजरते हैं। एक ही पुटी के भीतर 16 शुक्राणुओं का पूरा समूह फिर एक ही समय में पहले मेटियोटिक डिवीजन में प्रवेश करता है। इस प्रकार, कई मेओटिक शुक्राणुओं को एक साथ चित्रित किया जा सकता है क्योंकि वे सेल डिवीजन के माध्यम से आगे बढ़ते हैं। पहला मेयोटिक डिवीजन लगभग 1.5 घंटे के लिए आय करता है और इसका पालन लगभग तुरंत दूसरे मेयोटिक डिवीजन द्वारा किया जाता है, जो 64 कुल शुक्राणुओं को पैदा करता है जो परिपक्व शुक्राणुओं में अंतर करते हैं।
लाइव, बरकरार ऊतक में कोशिका विभाजन का अध्ययन करने के लिए शुक्राणुओं का उपयोग करने का एक अनूठा लाभ यह है कि शुक्राणुओं के विभिन्न चरणों के माध्यम से कोशिकाओं या अल्सर लगातार प्रगति करते हैं, और शुक्राणुओं के सभी चरणों में कोशिकाओं को आमतौर पर किसी भी टेस्टिस में पहचाना जा सकता है (चित्रा 3एदेखें)। इसलिए, पूरे टेस्ट में मेयोटिक कोशिकाओं को ढूंढना अपेक्षाकृत आसान है। हम आम तौर पर पहले पर हमारे विश्लेषण ध्यान केंद्रित के रूप में दूसरे meiosis के खिलाफ है क्योंकि इन कोशिकाओं को बहुत बड़ा और उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए उत्तरदायी हैं, लेकिन पूरी प्रक्रिया दोनों meiotic डिवीजनों शामिल सफलतापूर्वक छवि जा सकता है । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि टेस्टिस तैयारी और संस्कृति के लिए सामान्य प्रोटोकॉल का उपयोग शुक्राणुओं की अन्य प्रक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि पहले माइटोटिक स्टेम सेल या शुक्राणुविज्ञान ी विभाजन या शुक्राणुके रूप में होने वाले साइटोलॉजिकल परिवर्तनशुक्राणु15में परिपक्व होते हैं। शुक्राणुओं के जीनजनजनन के इनमें से कई पहलुओं को ड्रोसोफिला और मनुष्यों के बीच अत्यधिक संरक्षित किया गयाहै।
ड्रोसोफिला शुक्राणुओं को ड्रोसोफिला विकास13के तीसरे इंस्टार लार्वा चरण के दौरान शुक्राणुओं के मेयोटिक चरण तक पहुंचना शुरू हो जाता है । इसलिए, तीसरे इंस्टार लार्वा के साथ शुरू होने वाले जीवनचक्र चरणों से अलग किए गए टेस्ट और प्यूप्पे और वयस्कों सहित शुक्राणुओं को विभाजित करने के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है। शुक्राणुजनसंख्या17,18,,19के जीवित और निश्चित विश्लेषण के लिए वयस्क पुरुष मक्खियों से टेस्ट निकालने के लिए कई उत्कृष्ट प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं . ये प्रोटोकॉल शुक्राणुओं के देर से चरणों का अध्ययन करने के लिए बेहतर हो सकते हैं या यदि आनुवंशिक मार्कर जो केवल वयस्कों में दिखाई देते हैं, का उपयोग किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल लार्वा और शुरुआती पिल्ले से टेस्टिस तैयारी के बजाय केंद्रित है, क्योंकि इन चरणों में टेस्ट के कई फायदे हैं जो विशेष रूप से उच्च संकल्प, समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल डिवीजन विश्लेषण के लिए प्रासंगिक हैं। सबसे पहले, लार्वा और पिल्ले से टेस्ट वयस्कों की तुलना में छोटे होते हैं, और अंग के भीतर कोशिकाओं को कम भीड़ होती है। इस वजह से, शुक्राणुओं को विभाजित करना अक्सर लार्वा टेस्ट की बाहरी सतह के पास चित्रित किया जा सकता है, बिना प्रकाश बिखरने वाले ऊतककी कई परतों के माध्यम से प्रवेश किया जा सकता है। दूसरा, वयस्क टेस्ट संलग्न सहायक अंगों के संकुचन के कारण लयबद्ध रूप से चलते हैं, और ये आंदोलन व्यक्तिगत कोशिकाओं की समय-चूक इमेजिंग को चुनौती देते हैं। और तीसरा, लार्वा टेस्ट जीन म्यूटेशन का अध्ययन करते समय लाभप्रद होते हैं जो पुपल या वयस्क घातकता का कारण बनते हैं। हमारे तरीकों को माइक्रोस्कोप चरण पर टेस्ट की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए अनुकूलित किया जाता है, जिससे कोशिका विभाजन के कई दौर ों की इमेजिंग या एक ही तैयारी में शुक्राणुओं के कई चरणों के माध्यम से व्यक्तिगत कोशिकाओं की प्रगति की अनुमति मिलती है। हम पूरे टेस्ट के निर्धारण और इम्यूनोधुंधला के लिए एक प्रोटोकॉल का भी वर्णन करते हैं। कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल बरकरार ऊतक में सेल डिवीजन का अध्ययन करने में रुचि रखने वालों के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं, और अत्यधिक ट्रैक्टकरने योग्य ड्रोसोफिला आनुवंशिक उपकरणों के साथ शुक्राणुविज्ञान विश्लेषण को संयोजित करने की क्षमता इसे विशेष रूप से शक्तिशाली दृष्टिकोण बनाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने लार्वा या शुरुआती पुलपाल ड्रोसोफिला टेस्टकी तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल बताया है, जो दीर्घकालिक, शुक्राणुओं के सेल डिवीजन की लाइव इमेजिंग के लिए अनुकूलित है। यह अक्षुण्ण ऊतक के शारीरिक संदर्भ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को रक्षा विभाग स्टार्ट-अप फंडद्वारा जेटी एस को समर्थन दिया गया था ।
Materials
| 5" Dissecting Probe | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Glass Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Straight forcepts with fine tips |
| Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Gas-permeable tissue culture dish |
| Microscope Cover Glass | Fisher | 12-541-B | 22×22 mm, #1.5 glass coverslip |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Insect pins used to make scalpel tool |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade | Electron Microsocopy Sciences | 15714 | |
| Plan Beveled Edge Microscope Slides | Fisher | 12-549-5 | Slides used for dissections |
| PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 9-well glass dissecting dish |
| Schneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Syringe Filter, 0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Microscopy mounting medium |
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