Beskrevet her er en stereotaktisk prosedyre som kan målrette utfordrende og vanskelig tilgjengelige hjerneregioner (på grunn av romlige begrensninger) ved hjelp av en vinklet koronar tilnærming. Denne protokollen er tilpasningsdyktig til både mus- og rottemodeller og kan brukes på forskjellige nevrovitenskapelige applikasjoner, inkludert kanyleimplantasjon og mikroinjeksjoner av virale konstruksjoner.
Stereotaktisk kirurgi er et viktig verktøy i det moderne nevrovitenskapslaboratoriet. Evnen til å målrette mot vanskelige hjerneregioner er imidlertid fortsatt en utfordring, spesielt når man retter seg mot hjernestrukturer langs midtlinjen. Disse utfordringene inkluderer å unngå den overlegne skytten sinus og tredje ventrikel og evnen til konsekvent å målrette selektive og diskrete hjernekjerner. I tillegg er mer avanserte nevrovitenskapelige teknikker (f.eks. optogenetikk, fiberfotometri og to-fotonavbildning) avhengige av målrettet implantasjon av betydelig maskinvare til hjernen, og romlige begrensninger er en vanlig hindring. Presentert her er en modifiserbar protokoll for stereotaktisk målretting av gnagerhjernestrukturer ved hjelp av en vinklet koronal tilnærming. Det kan tilpasses 1) mus- eller rottemodeller, 2) ulike nevrovitenskapsteknikker og 3) flere hjerneregioner. Som et representativt eksempel inkluderer det beregning av stereotaktiske koordinater for målretting av musen hypothalamus ventromedial kjerne (VMN) for et optogenetisk hemmingseksperiment. Denne prosedyren begynner med bilateral mikroinjeksjon av et adeno-assosiert virus (AAV) som koder en lysfølsom kloridkanal (SwiChR ++) til en Cre-avhengig musemodell, etterfulgt av vinklet bilateral implantasjon av fiberoptisk kanyle. Ved hjelp av denne tilnærmingen viser funn at aktivering av en undergruppe av VMN-nevroner er nødvendig for intakt glukose kontraregulatorisk respons på insulinindusert hypoglykemi.
Nevral kontroll av atferd, fôring og metabolisme innebærer koordinering av svært komplekse, integrative og overflødige nevrokretser. Et drivende mål for nevrovitenskapsfeltet er å dissekere forholdet mellom nevronal kretsstruktur og funksjon. Selv om klassiske nevrovitenskapelige verktøy (dvs. lesjon, lokale farmakologiske injeksjoner og elektrisk stimulering) har avdekket viktig kunnskap om rollen til spesifikke hjerneregioner som kontrollerer atferd og metabolisme, er disse verktøyene begrenset av deres mangel på spesifisitet og reversibilitet1.
Nylige fremskritt innen nevrovitenskap har forbedret evnen til å forhøre og manipulere kretsfunksjonen på en cellespesifikk måte med høy romlig oppløsning. Optogenetiske2- og kjemogenetiske3-tilnærminger, for eksempel, tillater rask og reversibel manipulering av aktivitet i genetisk definerte celletyper av fritt bevegelige dyr. Optogenetikk innebærer bruk av lysfølsomme ionkanaler, kalt channelrhodopsins, for å kontrollere nevronaktivitet. Nøkkelen til denne teknikken er genlevering av channelrhodopsin og en lyskilde for å aktivere opsin. En vanlig strategi for genlevering er gjennom en kombinasjon av 1) genmodifiserte mus som uttrykker Cre-rekombininase i diskrete nevroner, og 2) Cre-avhengige virale vektorer som koder channelrhodopsin.
Mens optogenetikk gir en elegant, svært presis måte å kontrollere nevronaktivitet, metoden er betinget av vellykket stereotaktisk mikroinjeksjon av viral vektor og fiberoptisk plassering i en definert hjerneregion. Selv om stereotaktiske prosedyrer er vanlig i det moderne nevrovitenskapslaboratoriet (og det er flere gode protokoller som beskriver denne prosedyren)4,5,6, å kunne konsekvent og reprodusere diskrete hjerneregioner langs midtlinjen (dvs. middelmådig hypothalamus, et hjerneområde som er kritisk for reguleringen av homeostatiske funksjoner7) gir ytterligere utfordringer. Disse utfordringene inkluderer å unngå den overlegne skytten sinus, tredje ventrikel og tilstøtende hypothalamuskjerner. I tillegg er det betydelige romlige begrensninger for bilateral implantasjon av maskinvare som kreves for hemmingsstudier. Med disse utfordringene i tankene presenterer denne protokollen heri en modifiserbar prosedyre for å målrette diskrete hjerneregioner via en vinklet stereotaktisk tilnærming.
Nylige fremskritt innen nevrovitenskap har støttet avansert innsikt og forståelse av aktiviteten og funksjonen til hjerne nevrokretser. Dette inkluderer anvendelsen av optogenetiske og kjemogenetiske teknologier for å aktivere eller kneble diskrete nevronpopulasjoner og deres projeksjonssteder in vivo. Mer nylig har dette inkludert utviklingen av genetisk kodede kalsiumindikatorer (f.eks. GCaMP, RCaMP) og andre fluorometriske biosensorer (f.eks. dopamin, noradrenalin) for in vivo-registrering av nevronaktivitet i en d…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) tilskudd F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), en American Diabetes Association Innovative Basic Science Award (#1-19-IBS-192 til G.J.M.) og NIDDK-finansiert Nutrition Obesity Research Center (DK-035816), Diabetes Research Center (DK-017047) og Diabetes, Fedme og metabolisme trening Grant T32 DK0007247 (T.H.M) ved University of Washington.
Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | — | |
Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |