Ballistisk mærkning af pyramideformede neuroner i hjerneskiver og i primærcellekultur
Summary
Vi præsenterer en protokol til at mærke og analysere pyramideformede neuroner, som er afgørende for at evaluere potentielle morfologiske ændringer i neuroner og dendritiske pigge, der kan ligge til grund for neurokemiske og adfærdsmæssige abnormiteter.
Abstract
Det er blevet rapporteret, at størrelsen og formen af dendritiske pigge er relateret til deres strukturelle plasticitet. For at identificere den morfologiske struktur af pyramideformede neuroner og dendritiske pigge, en ballistisk mærkning teknik kan udnyttes. I den nuværende protokol, pyramideformede neuroner er mærket med DilC18 (3) farvestof og analyseres ved hjælp af neuronal rekonstruktion software til at vurdere neuronal morfologi og dendritiske pigge. At undersøge neuronal struktur, dendritic forgrening analyse og Sholl analyse udføres, så forskerne til at drage slutninger om dendritic forgrening kompleksitet og neuronal arbor kompleksitet, henholdsvis. Evalueringen af dendritiske pigge udføres ved hjælp af en automatisk assisteret klassificering algoritme integreret i genopbygningen software, som klassificerer pigge i fire kategorier (dvs. tynd, champignon, stubby, filopodia). Desuden vælges der yderligere tre parametre (dvs. længde, hoveddiameter og volumen) for at vurdere ændringer i dendritisk rygsøjlemorfologi. For at validere potentialet i bred anvendelse af den ballistiske mærkningsteknik blev pyramideformede neuroner fra in vitro-cellekultur med succes mærket. Samlet set er den ballistiske mærkningsmetode unik og nyttig til visualisering af neuroner i forskellige hjerneregioner hos rotter, som i kombination med sofistikeret rekonstruktionssoftware giver forskerne mulighed for at belyse de mulige mekanismer, der ligger til grund for neurokognitiv dysfunktion.
Introduction
I 2000 beskrev Gan et al. en hurtig mærkningsteknik for individuelle neuroner og glia i nervesystemet, der kombinerede forskellige lipofile farvestoffer, hvilket gav mulighed for samtidig mærkning af mange hjerneceller med forskellige farver1,2. For nylig, en ballistisk mærkning teknik blev beskrevet af Seabold et al.3, der indførte fluorescerende farvestoffer (Dil) i neuroner af hjerneskiver. En alsidig farvning teknik, ballistiskmærkning er værdsat for sin evne til at blive udnyttet i flere dyrearter og på tværs af en bred vifte af aldre. Desuden kan det kombineres med immunfarvning for at identificere delpopulationer af hjerneceller3. Sammenlignet med traditionelle teknikker (f.eks Golgi-Cox sølv imprægnering, mikroinjektion)4, ballistiske mærkning giver mulighed for at mere klart skelne morfologiske egenskaber, herunder dendritiske pigge, en funktion, der er afgørende for at drage slutninger om neuronal kompleksitet og synaptisktilslutningsmuligheder 5.
Excitatoriske pyramideformede neuroner er karakteriseret ved en enkelt, stor apilogisk dendrite, flere kortere basal dendritter, og tusindvis af dendritiske pigge6. Pyramideformede neuroner findes i flere hjerneregioner relateret til højere orden kognitiv behandling, herunder den præfrontale cortex (PFC) og hippocampus. I PFC observeres pyramideformede neuroner i lag II/III og lag V, hvor hver udviser unik morfologi. Specifikt pyramideformede neuroner i lag II/III af PFC har en kortere apilogisk dendrite og mindre forgrening end pyramideformede neuroner i lag V6. Inden for hippocampus, pyramideformede neuroner er placeret i både CA1 og CA3 regioner, med hver viser forskellige morfologier. Specifikt, pyramideformede neuroner i CA1 regionen udviser en mere karakteristisk apitisk dendrite, med forgrening forekommer længere fra soma, i forhold til CA3 regionen6.
Dendritiske pigge på pyramideformede neuroner i både PFC og hippocampus er det primære sted for excitatoriske synapser7. Morfologiske egenskaber af dendritiske pigge, som er klassisk karakteriseret i tre primære kategorier (dvs. tynde, stubby, eller champignon8), har været relateret til størrelsen af excitatoriske synapse9. Tynde pigge, karakteriseret ved en lang, tynd hals, lille løgformet hoved, og mindre postsynaptiske tætheder, er mere ustabile og udvikle svagere forbindelser. Men svampe pigge, som har en større dendritisk rygsøjlen hoved, er anerkendt for at danne stærkere synaptiske forbindelser, en effekt som følge af deres større størrelse. I skarp kontrast, stubby pigge er blottet for en rygsøjle hals, udviser en omtrent lige hoved og hals volumen forhold8. Inden for hippocampus, forgrenede pigge kan også observeres, hvorved rygsøjlen har flere hoveder, der kommer ud af samme dendritiske rygsøjlen hals10. Derfor kan de morfologiske ændringer af dendritiske pigge afspejle funktionalitet og strukturel kapacitet. Desuden har undersøgelser vist, at størrelsen og formen af dendritiske pigge vedrører deres strukturelle plasticitet, hvilket fører til tanken om, at små pigge er involveret i læring og opmærksomhed, mens større, mere stabile pigge, er involveret i langsigtede processer, herunder hukommelse11. Desuden kan fordelingen af dendritiske pigge langs dendrite være forbundet med synaptisktilslutning5,12.
Således den nuværende metodiske papir har tre mål: 1) Præsenter vores protokol for ballistiskmærkning, som er blevet udnyttet med en succesrate (dvs. neuroner opfylder udvælgelseskriterier og passende til analyse) på 83,3%5,12,13 og på tværs af flere hjerne regioner (dvs. PFC, kerne accumbens, hippocampus); 2) Demonstrere generaliserbarheden af teknikken og dens anvendelse på neuroner dyrket in vitro; 3) Nærmere oplysninger om den metode, der anvendes i neuronal genopbygning software og de slutninger, der kan drages af sådanne data.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol beskriver vi en alsidig mærkningsteknik til neuroner fra både rottehjernen og dem, der dyrkes in vitro. Desuden rapporterer vi metoden til at udnytte neuronal rekonstruktion software og neuronal rekonstruktion kvantitative analyse software til at vurdere neuronal morfologi og dendritiske pigge. Vurderingen af neuronal morfologi og dendritiske pigge giver mulighed for at bestemme ændringer i dendritisk forgrening kompleksitet, neuronal arbor kompleksitet, dendritiske rygsøjlen morfologi, og synaptiske…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud HD043680, MH106392, DA013137, og NS100624.
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor “DiOlistic” labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neurosciences. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neurosciences. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
