Det nuvarande protokollet fastställer en rigorös och reproducerbar metod för kvantifiering av morfologiska gemensamma förändringar som åtföljer artros. Tillämpning av detta protokoll kan vara värdefullt för att övervaka sjukdomsprogression och utvärdera terapeutiska interventioner i artros.
En av de vanligaste ledstörningarna i USA, artros (OA) kännetecknas av progressiv degeneration av ledbrosk, främst i höft- och knälederna, vilket resulterar i betydande effekter på patientens rörlighet och livskvalitet. Hittills finns det inga befintliga botande terapier för OA kunna bromsa eller hämma brosk degeneration. För närvarande finns det en omfattande mängd pågående forskning för att förstå OA patologi och upptäcka nya terapeutiska metoder eller medel som effektivt kan sakta ner, stoppa, eller ens vända OA. Det är därför viktigt att ha en kvantitativ och reproducerbar metod för att noggrant utvärdera OA-associerade patologiska förändringar i ledbrosk, synovium och subkondral ben. För närvarande, OA svårighetsgrad och progression bedöms främst med hjälp av Artros Research Society International (OARSI) eller Mankin scoring system. Trots betydelsen av dessa poängsystem, de är semiquantitative och kan påverkas av användarens subjektivitet. Ännu viktigare, de misslyckas med att exakt utvärdera subtila, men ändå viktigt, förändringar i brosk under de tidiga sjukdomstillstånd eller tidig behandling faser. Protokollet vi beskriver här använder en datoriserad och halvautomatiserad histomorphometrisk programvara för att upprätta en standardiserad, rigorös och reproducerbar kvantitativ metod för utvärdering av gemensamma förändringar i OA. Detta protokoll presenterar ett kraftfullt tillägg till de befintliga systemen och möjliggör effektivare upptäckt av patologiska förändringar i leden.
En av de vanligaste ledstörningarna i USA, OA kännetecknas av progressiv degeneration av ledbrosk, främst i höft- och knälederna, vilket resulterar i betydande effekter på patientens rörlighet och livskvalitet1,2,3. Ledbrosk är den specialiserade bindväv av diarthrodial lederna för att minimera friktion, underlätta rörelse, och uthärda ledkompression4. Ledbrosket består av två primära komponenter: kondrocyter och extracellulär matris. Kondrocyter är specialiserade, metaboliskt aktiva celler som spelar en primär roll i utveckling, underhåll och reparation av den extracellulära matrisen4. Chondrocyte hypertrofi (CH) är en av de viktigaste patologiska tecken på OA utveckling. Det kännetecknas av ökad cellulär storlek, minskad proteoglykan produktion, och ökad produktion av brosk matris-förnedrande enzymer som så småningom leder till brosk degeneration5,6,7. Vidare spelar patologiska förändringar i ledens subkondrila ben och synovium en viktig roll i OA-utveckling och progression8,,9,,10,,11,12. Hittills finns det inga befintliga botande behandlingar som hämmar broskdegeneration1,,2,,3,,13,14. Således finns det omfattande pågående forskning som syftar till att förstå OA patologi och upptäcka nya terapeutiska metoder som kan bromsa eller till och med stoppa OA. Följaktligen finns det ett ökande behov av en kvantitativ och reproducerbar metod som möjliggör noggrann utvärdering av OA-associerade patologiska förändringar i brosk, synovium och subkondral ben i leden.
För närvarande bedöms OA svårighetsgrad och progression främst med hjälp av OARSI eller Mankin scoring system15. Dessa poängsystem är dock bara semikvantativa och kan påverkas av användarens subjektivitet. Ännu viktigare, de misslyckas med att exakt utvärdera subtila förändringar som uppstår i leden under sjukdom eller som svar på genetisk manipulation eller en terapeutisk intervention. Det finns sporadiska rapporter i litteraturen som beskriver histomorphometriska analyser av brosk, synovium eller subkondralben16,17,18,19,20,21. Ett detaljerat protokoll för rigorös och reproducerbar histomorphometrisk analys av alla dessa gemensamma komponenter saknas dock fortfarande, vilket skapar ett otillfredsställt behov på fältet.
För att studera patologiska förändringar i OA med hjälp av histomorphometrisk analys, använde vi en kirurgisk OA mus modell för att inducera OA via destabilisering av den mediala menisken (DMM). Bland de etablerade modellerna av murine OA, DMM valdes för vår studie eftersom det innebär en mindre traumatisk mekanism för skada22,23,24,25,26. I jämförelse med meniscal-ligamentous skada (MLI) eller främre korsbandsskada (ACLI) operationer, DMM främjar en mer gradvis progression av OA, liknande OA utveckling hos människor22,24,25,26. Möss avlivades tolv veckor efter DMM kirurgi för att utvärdera förändringar i artikulära brosk, subkondral ben och synovium.
Målet med detta protokoll är att upprätta en standardiserad, rigorös och kvantitativ metod för att utvärdera gemensamma förändringar som åtföljer OA.
Nyligen artros forskning har ökat vår förståelse av överhörningen mellan de olika vävnaderna i leden och den roll varje vävnad spelar i sjukdomsinitiering eller progression8,9,10,35,36. Det har därför blivit uppenbart att bedömningen av OA inte bör begränsas till analys av brosket utan även omfatta analys av det subkondrala benet och synoviumet. …
The authors have nothing to disclose.
Vi vill erkänna hjälp av Institutionen för jämförande medicin personal och molekylära och histopathology kärna på Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Finansieringskällor: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).
10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
Histosette II Tissue Cassettes – Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
ThinkBoneStage – Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. – OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |