Axonal transport af organeller i motorneuronkulturer ved hjælp af microfluidic Chambers System
Summary
Axonal transport er en afgørende mekanisme for motor neuron sundhed. I denne protokol giver vi en detaljeret metode til sporing af aksonal transport af sure rum og mitokondrier i motorneuronaxoner ved hjælp af mikrofluidiske kamre.
Abstract
Motor neuroner (MNs) er stærkt polariserede celler med meget lange axoner. Axonal transport er en afgørende mekanisme for MN sundhed, der bidrager til neuronal vækst, udvikling og overlevelse. Vi beskriver en detaljeret metode til brug af mikrofluidiske kamre (MCC’ er) til sporing af axonal transport af fluorescerende mærkede organeller i MN axoner. Denne metode er hurtig, relativt billig, og giver mulighed for overvågning af intracellulære signaler i tid og rum. Vi beskriver en trinvis protokol for: 1) Fremstilling af polydimethylsiloxan (PPC’er) MPC’er; 2) Plating af ventralrygmarvexplanter og MN dissocieret kultur i MPC’er; 3) Mærkning af mitokondrier og sure rum efterfulgt af levende konfokal fantasi; 4) Manuel og halvautomatisk axonal transport analyse. Endelig viser vi en forskel i transporten af mitokondrier og sure rum i HB9::GFP ventral rygmarvexplantaxoner som bevis for systemets gyldighed. Alt i alt er denne protokol et effektivt værktøj til at studere aksonal transport af forskellige aksonale komponenter, samt en forenklet manual for MFC brug for at hjælpe med at opdage rumlige eksperimentelle muligheder.
Introduction
N’er er stærkt polariserede celler med lange axoner og når op til en meter lang hos voksne mennesker. Dette fænomen skaber en kritisk udfordring for vedligeholdelsen af MN-forbindelse og -funktion. Derfor, Ncs afhænger af korrekt transport af information, organeller, og materialer langs axoner fra deres celle krop til synapsen og tilbage. Forskellige cellulære komponenter, såsom proteiner, RNA, og organeller er shuttled regelmæssigt gennem axoner. Mitokondrier er vigtige organeller, der rutinemæssigt transporteres i Menneskers Grænser. Mitokondrier er afgørende for korrekt aktivitet og funktion af Menneskers tandområder, der er ansvarlige for ATP bestemmelse, calcium buffering, og signalering processer1,2. Den axonale transport af mitokondrier er en velstuderet proces3,4. Interessant, defekter i mitokondriel transport blev rapporteret at være involveret i flere neurodegenerative sygdomme og specifikt i MN sygdomme5. Sure rum tjener som et andet eksempel for iboende organeller, der bevæger sig langs MN axoner. Sure rum omfatter lysosomer, endosomer, trans-Golgi apparater, og visse sekretoriske vesikler6. Fejl i aksonal transport af sure rum blev fundet i flere neurodegenerative sygdomme samt7, og de seneste papirer fremhæve deres betydning i MN sygdomme8.
For effektivt at kunne studere axonal transport anvendes mikrofluidiske kamre, der adskiller somatiske og axonalerum,ofte9,10. De to betydelige fordele ved mikrofluidic system, og segmentering og isolering af axoner, gør det ideelt til undersøgelse af subcellulære processer11. Den rumlige adskillelse mellem de neuronale cellelegemer og axoner kan bruges til at manipulere de ekstracellulære miljøer i forskellige neuronale rum (f.eks. axoner vs. soma). Biokemiske, neuronal vækst /degeneration, og immunofluorescens analyser alle drage fordel af denne platform. MCC’er kan også hjælpe med at studere celle-til-celle kommunikation ved at coculturing neuroner med andre celletyper, såsom skeletmuskulatur12,13,14.
Her beskriver vi en enkel, men præcis protokol til overvågning af mitokondrier og sure rumtransport er i motoriske neuroner. Vi viser endvidere brugen af denne metode ved at sammenligne den relative procentdel af retrograd og anterograd bevægelige organeller, samt fordelingen af transporthastighed.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol beskriver vi et system til at spore axonal transport af mitokondrier og sure rum i motoriske neuroner. Denne forenklede in vitro-platform giver mulighed for præcis kontrol, overvågning og manipulation af subcellulære neuronale rum, hvilket muliggør eksperimentel analyse af motorneuronlokale funktioner. Denne protokol kan være nyttig til at studere MN sygdomme som ALS, at fokusere på at forstå den underliggende mekanisme af axonal transport dysfunktion i sygdommen10,</s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Israel Science Foundation (ISF, 561/11) og Det Europæiske Forskningsråd (EF, 309377).
Materials
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
- Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
- Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
- Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
- Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
- Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
- Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
- Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
- Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).
