Le transport axonal est un mécanisme crucial pour la santé des neurones moteurs. Dans ce protocole, nous fournissons une méthode détaillée pour suivre le transport axonal des compartiments acides et des mitochondries dans les axones des neurones moteurs à l’aide de chambres microfluidiques.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Transport axonal des Organlles dans les cultures de neurones moteurs à l’aide du système de chambres microfluidiques
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les neurones moteurs (MNs) sont des cellules fortement polarisées avec de très longs axones. Le transport axonal est un mécanisme crucial pour la santé de MN, contribuant à la croissance neuronale, au développement, et à la survie. Nous décrivons une méthode détaillée pour l’utilisation des chambres microfluidiques (MFC) pour le suivi du transport axonal des organites étiquetés fluorescents dans les axones MN. Cette méthode est rapide, relativement peu coûteuse, et permet la surveillance des indices intracellulaires dans l’espace et le temps. Nous décrivons un protocole étape par étape pour : 1) Fabrication de MFC en polydiméthylsiloxane (PDMS); 2) Le plating des explantations ventrales de moelle épinière et de la culture dissociée de MN dans les CFC ; 3) Étiquetage des mitochondries et des compartiments acides suivis de l’imagination confocale vivante; 4) Analyse de transport axonal manuelle et semi-automatique. Enfin, nous démontrons une différence dans le transport des mitochondries et des compartiments acides de HB9::GFP ventrale moelle épinière explant axones comme une preuve de la validité du système. Au total, ce protocole fournit un outil efficace pour étudier le transport axonal de divers composants axonaux, ainsi qu’un manuel simplifié pour l’utilisation de MFC pour aider à découvrir les possibilités expérimentales spatiales.
Introduction
Les MN sont des cellules fortement polarisées avec de longs axones, atteignant jusqu’à un mètre de long chez les humains adultes. Ce phénomène crée un défi critique pour le maintien de la connectivité et de la fonction MN. Par conséquent, les MN dépendent d’un bon transport d’informations, d’organites et de matériaux le long des axones de leur corps cellulaire à la synapse et au dos. Divers composants cellulaires, tels que les protéines, l’ARN et les organites, sont transportés régulièrement à travers les axones. Les mitochondries sont des organites importants qui sont systématiquement transportés dans les MN. Les mitochondries sont essentielles pour une activité et u....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Les soins et le traitement des animaux dans ce protocole ont été effectués sous la supervision et l’approbation du Comité universitaire d’éthique animale de l’Université de Tel Aviv.
1. Préparation MFC
- PDMS coulé dans les moules primaires (Figure 1)
- Acheter ou créer des moules primaires (gaufrettes) suivant un protocole détaillé9.
- Utilisez de l’air pressurisé pour enlever tout type de saleté de la plate-forme de gaufrettes avant de passer à l’étape de revêtement. La surface des gaufrettes doit sembler lisse et claire.
- Remplir un contenant de 50 ml ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Suivant le protocole décrit, souris embryonnaire HB9::GFP épidullaires explants ont été cultivés dans MFC (figure 4A). Les explantations ont été cultivées pendant 7 jours, quand les axones ont complètement traversé dans le compartiment distal. Mitotracker Deep Red et Lysotracker Des colorants rouges ont été ajoutés aux compartiments distal et proximal afin d’étiqueter les mitochondries et les compartiments acides(figure 4.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons un système pour suivre le transport axonal des mitochondries et des compartiments acides dans les neurones moteurs. Cette plate-forme in vitro simplifiée permet un contrôle précis, la surveillance et la manipulation des compartiments neuronaux subcellulaires, permettant l’analyse expérimentale des fonctions locales des neurones moteurs. Ce protocole peut être utile pour étudier les maladies de MN telles que la SLA, pour se concentrer sur la compréhension du mécanisme sous-jacent du dysfo.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la Fondation israélienne pour la science (ISF, 561/11) et du Conseil européen de recherches (ERC, 309377).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plat à fond en verre 35mm | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| Plat à fond en verre 50mm | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 Caméra EMCCD | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine &beta ;-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock de 2mM en filtre Supplément DDW |
| B-27 (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilué à 10 µ ; g/mL dans du ddw filtré avec 0,01 % BSA) |
| Poinçon de biopsie 1,25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | Pour la préparation d’un grand |
| poinçon de biopsie MFC 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | Pour la préparation d’un petit |
| poinçon de biopsie MFC 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | Pour la préparation d’un grand |
| MFC Bitplane Logiciel Imaris - version 8.4.1 | Imaris | ||
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5 % p/v dans ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Diluer à 10 µ ; g/mL dans du ddw filtré avec 0,01 % BSA) |
| Gradient de densité moyen - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Déoxyribonucléase I (DNAse) du pancréas bovin | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL dans la graisse silicone neurobasale |
| Dow Corning Graisse silicone sous vide poussé | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | Pour la préparation du moule époxy |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | Diluer 1:10 en DDW |
| Pince fine Dumont #55 0.05 × ; 0.02 mm | F.S.T | ||
| Durcisseur époxy | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | Pour la préparation de moules époxy |
| Résine époxy | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | Pour la préparation de moules époxy FIJI |
| software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Diluer à 10 µ ; g/mL dans de la ddw filtrée avec 0,01 % BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9 :GFP souche | de souris Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Diluer 1:10 dans ddw avec ajout de 1 % P/S et filtre |
| iQ software | Andor | ||
| Iris ciseaux, courbés, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Ciseaux à iris, droits, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Milieu neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Pénicilline-Streptomycine (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilué 1:1000 dans un kit d’élastomère de silicone 1X PBS |
| Sylgard 184 | modifié DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsine du pancréas bovin | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL dans des |
| ciseaux de microdissection à ressort | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
Références
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neu....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
