माइक्रोफ्लूइडिक चैम्बर्स सिस्टम का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन संस्कृतियों में ऑर्गेनेल्स का एक्सोनल परिवहन
Summary
अक्षीय परिवहन मोटर न्यूरॉन स्वास्थ्य के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र है। इस प्रोटोकॉल में हम माइक्रोफ्लूइडिक कक्षों का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन एक्सोन में अम्लीय डिब्बों और माइटोकॉन्ड्रिया के अक्षीय परिवहन को ट्रैक करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करते हैं।
Abstract
मोटर न्यूरॉन्स (एमएनएस) बहुत लंबे समय तक अक्षतके साथ अत्यधिक ध्रुवीकृत कोशिकाएं हैं। एक्सोनल परिवहन एमएन स्वास्थ्य के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र है, जो न्यूरोनल विकास, विकास और अस्तित्व में योगदान देता है। हम एमएन एक्सॉन में फ्लोरोसेंटी लेबल ऑर्गेनेल्स के एक्सोनल परिवहन पर नज़र रखने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक कक्षों (एमएफसी) के उपयोग के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं। यह विधि तेजी से, अपेक्षाकृत सस्ती है, और अंतरिक्ष और समय में इंट्रासेलुलर संकेतों की निगरानी के लिए अनुमति देती है। हम के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम का वर्णन: 1) पॉलीडिमिथाइलसिलिक्साने (पीडीएम) एमएफसी का निर्माण; 2) मेएफसी में वेंट्रल रीढ़ की हड्डी के एक्सप्लांट ्स और एमएन विसोसिएटेड संस्कृति की चढ़ाना; 3) माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों की लेबलिंग लाइव कॉन्फोकल इमेजिंग के बाद; 4) मैनुअल और अर्धस्वचालित एक्सोनल परिवहन विश्लेषण। अंत में, हम एचबी9 के माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों के परिवहन में अंतर प्रदर्शित करते हैं::GFP वेंट्रल रीढ़ की हड्डी एक्सप्लांट एक्सप्लांट एक्सोन सिस्टम वैधता के सबूत के रूप में। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल विभिन्न एक्सोनल घटकों के अक्षीय परिवहन का अध्ययन करने के साथ-साथ स्थानिक प्रयोगात्मक संभावनाओं की खोज में मदद करने के लिए एमएफसी उपयोग के लिए एक सरलीकृत मैनुअल प्रदान करता है।
Introduction
एमएनएस लंबे अक्षों के साथ अत्यधिक ध्रुवीकृत कोशिकाएं हैं, जो वयस्क मनुष्यों में एक मीटर तक लंबी तक पहुंच ती हैं। यह घटना एमएन कनेक्टिविटी और कार्य के रखरखाव के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती पैदा करती है। नतीजतन, एमएनएस अपने सेल शरीर से सिनेप्स और बैक तक एक्सोन के साथ जानकारी, ऑर्गेनेल्स और सामग्रियों के उचित परिवहन पर निर्भर करते हैं। विभिन्न सेलुलर घटक, जैसे प्रोटीन, आरएनए और ऑर्गेनेल्स को नियमित रूप से एक्सोन के माध्यम से शटल किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण ऑर्गेनेल्स हैं जिन्हें नियमित रूप से एमएनएस में ले जाया जाता है। मिटोकॉन्ड्रिया एमएनएस की उचित गतिविधि और कार्य के लिए आवश्यक हैं, जो एटीपी प्रावधान, कैल्शियम बफरिंग और सिग्नलिंग प्रक्रियाओं1,,2के लिए जिम्मेदार हैं। माइटोकॉन्ड्रिया का एक्सोनल ट्रांसपोर्ट एक अच्छी तरह से अध्ययन की गई प्रक्रिया3,4है । दिलचस्प बात यह है कि माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन में दोष कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में और विशेष रूप से एमएनरोगों 5में शामिल होने की सूचना मिली थी । अम्लीय डिब्बे आंतरिक ऑर्गेनेल्स के लिए एक और उदाहरण के रूप में काम करते हैं जो एमएन एक्सॉन के साथ चलते हैं। अम्लीय डिब्बों में लिसोसोम्स, एंडोसोम्स, ट्रांस-गोलगी उपकरण और कुछ स्रावात्मक वेसिकल्स6शामिल हैं। अम्लीय डिब्बों के अक्षत के परिवहन में दोष कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के साथ – साथ7में पाए गए और हाल के पत्र एमएनरोगों 8में उनके महत्व को उजागर करते हैं ।
एक्सोनल परिवहन का कुशलतापूर्वक अध्ययन करने के लिए, सूक्ष्म तरल कक्ष जो अलग-अलग दैहिक और एक्सोनल डिब्बों का उपयोग अक्सर9,,10करते हैं। माइक्रोफ्लूइडिक प्रणाली के दो महत्वपूर्ण फायदे, और डिब्बेीकरण और एक्सोन का अलगाव, इसे उपसेलुलर प्रक्रियाओं11के अध्ययन के लिए आदर्श प्रदान करता है। न्यूरोनल सेल निकायों और एक्सोन के बीच स्थानिक अलगाव का उपयोग विभिन्न न्यूरोनल डिब्बों (जैसे, अक्षों बनाम सोमा) के बाह्य वातावरण में हेरफेर करने के लिए किया जा सकता है। जैव रासायनिक, न्यूरोनल विकास/पतन, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस इस मंच से सभी लाभ कहते हैं । एमएफसी अन्य सेल प्रकारों के साथ न्यूरॉन्स को कोकुल्चरिंग करके सेल-टू-सेल संचार का अध्ययन करने में भी सहायता कर सकता है, जैसे कंकाल की मांसपेशियां12,,13,,14।
यहां, हम मोटर न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बे परिवहन की निगरानी के लिए एक सरल अभी तक सटीक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम आगे प्रतिगामी और पूर्ववर्ती चलती ऑर्गेनेल्स के सापेक्ष प्रतिशत की तुलना करके इस विधि के उपयोग को दिखाते हैं, साथ ही परिवहन वेग के वितरण को भी दिखाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम मोटर न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों के अक्षत परिवहन को ट्रैक करने के लिए एक प्रणाली का वर्णन करते हैं। यह सरलीकृत इन विट्रो प्लेटफ़ॉर्म मोटर न्यूरॉन स्थानीय कार…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ, 561/11) और यूरोपियन रिसर्च काउंसिल (ईआरसी, 309377) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
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