Transporte axónico de organelos en cultivos de neuronas motoras utilizando el sistema de cámaras microfluídicas
Summary
El transporte axonal es un mecanismo crucial para la salud de las neuronas motoras. En este protocolo proporcionamos un método detallado para el seguimiento del transporte axonal de compartimentos ácidos y mitocondrias en axons de neuronas motoras utilizando cámaras microfluídicas.
Abstract
Las neuronas motoras (MN) son células altamente polarizadas con axones muy largos. El transporte axonal es un mecanismo crucial para la salud de la MN, contribuyendo al crecimiento neuronal, desarrollo, y la supervivencia. Describimos un método detallado para el uso de cámaras microfluídicas (MFC) para el seguimiento del transporte axonal de orgánulos etiquetados fluorescentemente en axones MN. Este método es rápido, relativamente barato, y permite el monitoreo de señales intracelulares en el espacio y el tiempo. Describimos un protocolo paso a paso para: 1) Fabricación de MFC de polidimetilsiloxano (PDMS); 2) Revestimiento de explantes de la médula espinal ventral y cultivo disociado MN en MFC; 3) Etiquetado de mitocondrias y compartimentos ácidos seguidode de imaginación confocal viva; 4) Análisis manual y semiautomatizado del transporte axonal. Por último, demostramos una diferencia en el transporte de mitocondrias y compartimentos ácidos de HB9::GFP de la médula espinal ventral explantó axons como prueba de la validez del sistema. En conjunto, este protocolo proporciona una herramienta eficaz para estudiar el transporte axonal de varios componentes axonales, así como un manual simplificado para el uso de MFC para ayudar a descubrir posibilidades experimentales espaciales.
Introduction
Las MN son células altamente polarizadas con axones largos, alcanzando hasta un metro de largo en humanos adultos. Este fenómeno crea un desafío crítico para el mantenimiento de la conectividad y la función MN. En consecuencia, los MN dependen del transporte adecuado de información, orgánulos y materiales a lo largo de los axones desde su cuerpo celular hasta la sinapsis y la espalda. Varios componentes celulares, como proteínas, ARN y orgánulos, se transportan regularmente a través de los axones. Las mitocondrias son orgánulos importantes que se transportan rutinariamente en MNs. Mitocondrias son esenciales para la actividad adecuada y el funcionamiento de los MN, responsables de la provisión de ATP, amortiguación de calcio, y procesos de señalización1,2. El transporte axonal de mitocondrias es un proceso bien estudiado3,4. Curiosamente, se informó que los defectos en el transporte mitocondrial estaban implicados en varias enfermedades neurodegenerativas y específicamente en enfermedades MN5. Los compartimentos ácidos sirven como otro ejemplo para los orgánulos intrínsecos que se mueven a lo largo de los axones MN. Los compartimentos ácidos incluyen lysososomes, endosomas, aparatos trans-Golgi, y ciertas vesículas secretoras6. Los defectos en el transporte axonal de compartimentos ácidos se encontraron en varias enfermedades neurodegenerativas, así como7,y los documentos recientes destacan su importancia en las enfermedades MN8.
Para estudiar eficientemente el transporte axonal, las cámaras microfluídicas que separan los compartimentos somáticos y axonales se utilizan con frecuencia9,10. Las dos ventajas significativas del sistema microfluídico, y la compartimentación y el aislamiento de los axons, lo hacen ideal para el estudio de procesos subcelulares11. La separación espacial entre los cuerpos celulares neuronales y los axons se puede utilizar para manipular los entornos extracelulares de diferentes compartimentos neuronales (por ejemplo, axones vs. soma). Los ensayos bioquímicos, de crecimiento/degeneración neuronal e inmunofluorescencia se benefician de esta plataforma. Las MFC también pueden ayudar a estudiar la comunicación de célula a célula cocultando neuronas con otros tipos de células, como los músculos esqueléticos12,,13,,14.
Aquí, describimos un protocolo simple pero preciso para monitorear las mitocondrias y el transporte del compartimiento ácido en las neuronas motoras. Además, mostramos el uso de este método comparando el porcentaje relativo de orgánulos en movimiento retrógrados y anterogrados, así como la distribución de la velocidad de transporte.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, describimos un sistema para rastrear el transporte axonal de mitocondrias y compartimentos ácidos en las neuronas motoras. Esta plataforma in vitro simplificada permite un control, monitoreo y manipulación precisos de los compartimentos neuronales subcelulares, lo que permite el análisis experimental de las funciones locales de las neuronas motoras. Este protocolo puede ser útil para el estudio de enfermedades MN como la ELA, para centrarse en la comprensión del mecanismo subyacente de la disfunci…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Israel Science (ISF, 561/11) y del Consejo Europeo de Investigación (ERC, 309377).
Materials
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
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