فحص المخدرات للمريض الأولي المشتقة الورم Xenografts في حمار وحشي
Summary
نماذج زيونوجراف وزينوجراف تسمح لفحص المخدرات عالية الإنتاجية والتصوير الفلورسنت للخلايا السرطانية البشرية في بيئة صغيرة في الجسم الحي. قمنا بتطوير سير عمل لفحص المخدرات على نطاق واسع آلي على عينات سرطان الدم المشتقة من المريض في سمك الحمار الوحشي باستخدام مجهر الفلورسينس الآلي مجهزوحدة التصوير.
Abstract
نماذج xenograft المشتقة من المريض حاسمة في تحديد كيفية استجابة السرطانات المختلفة للعلاج الدوائي في نظام في الجسم الحي. نماذج الماوس هي المعيار في هذا المجال، ولكن ظهرت حمار وحشي كنموذج بديل مع العديد من المزايا، بما في ذلك القدرة على فحص المخدرات عالية الإنتاجية ومنخفضة التكلفة. الحمار الوحشي يسمح أيضا في فحص المخدرات في الجسم الحي مع أعداد تكرار كبيرة التي كانت في السابق فقط يمكن الحصول عليها مع في النظم المختبرية. القدرة على أداء بسرعة شاشات المخدرات على نطاق واسع قد تفتح إمكانية للطب شخصية مع الترجمة السريعة للنتائج مرة أخرى إلى العيادة. يمكن أيضًا استخدام نماذج زينوسوهوتورفيش الوحشية للفحص السريع للطفرات القابلة للتنفيذ استنادًا إلى استجابة الورم للعلاجات المستهدفة أو لتحديد مركبات جديدة مضادة للسرطان من المكتبات الكبيرة. والقيود الرئيسية الحالية في هذا المجال هي تحديد العملية كميا وأتمتة هاوية بحيث يمكن إجراء شاشات الأدوية على نطاق أوسع وتكون أقل كثافة في اليد العاملة. لقد قمنا بتطوير سير عمل لعينات المريض الأولية xenografting في يرقات حمار وحشي وأداء شاشات المخدرات على نطاق واسع باستخدام مجهر الفلورسينس وحدة التصوير المجهزة ووحدة العينات الآلية. تسمح هذه الطريقة بتوحيد وقياس مساحة الورم المطعمة والاستجابة للعلاج الدوائي عبر أعداد كبيرة من يرقات سمك الحمار الوحشي. عموما، هذه الطريقة مفيدة على الخلايا التقليدية الخلايا فحص المخدرات لأنها تسمح لنمو الخلايا السرطانية في بيئة في الجسم الحي في جميع أنحاء العلاج بالعقاقير، وأكثر عملية وفعالة من حيث التكلفة من الفئران على نطاق واسع في شاشات المخدرات على الهواء.
Introduction
Xenografting من سرطانات المرضى الأولية أو خطوط الخلايا السرطانية البشرية في الكائنات الحية النموذجية هو تقنية تستخدم على نطاق واسع لدراسة تطور الورم والسلوك في الجسم الحي، واستجابة الورم للعلاج من المخدرات، وتفاعل الخلايا السرطانية مع البيئة الدقيقة، من بين أمور أخرى. تقليديا، يتم تطعيم الخلايا في الفئران المحصنة، وهذا لا يزال المعيار في هذا المجال. ومع ذلك، هذا النظام النموذجي لديه العديد من القيود، مثل ارتفاع التكلفة، وانخفاض الأرقام المتكررة، والصعوبات في تحديد حجم دقيق عبء الورم في الجسم الحي، والوقت الممتد الذي يستغرقه الأورام لغير المطعم واختبار المخدرات ليتم الانتهاء منها. في السنوات الأخيرة، ظهرت سمك الحمار الوحشي كنموذج xenograft بديل، مع أول يجري الإبلاغ عنها في عام 2005، مع البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وصفت خطوط خلايا الميلانوما البشرية المزروعة في الأجنة في مرحلة الانفجار1,,2. في الآونة الأخيرة، تم استخدام 2 يوم بعد الإخصاب (dpf) يرقات حمار وحشي كمستلمين xenograft للسماح للسيطرة على الموقع التشريحي للحقن واستخدامها في دقة عالية في تصوير الجسم الحي من تفاعل الورم مع البيئة الدقيقة المحيطة3,4.
حمار وحشي تقدم العديد من المزايا كنموذج xenograft. أولاً، يمكن إيواء سمك الحمار الوحشي البالغ وتربيته بسرعة بكميات كبيرة بتكلفة منخفضة نسبياً. يمكن لكل زوج من التزاوج من سمك الحمار الوحشي البالغ إنتاج مئات من الأسماك اليرقات في الأسبوع. نظرًا لصغر حجمها ، يمكن الحفاظ على هذه السمكة الوحشية اليرقية في 96 لوحة جيدة لفحص المخدرات عالية الإنتاجية. لا يجب تغذية اليرقات أثناء تجربة xenograft النموذجية ، حيث يوفر صفارها – كيس العناصر الغذائية للحفاظ عليها في الأسبوع الأول من حياتها. وعلاوة على ذلك، لا تحتوي سمك الحمار الوحشي على جهاز مناعي يعمل بكامل طاقته حتى 7 dpf، مما يعني أنها لا تتطلب تشعيع أو نظم مثبطة للمناعة قبل حقن xenograft. وأخيراً، تسمح خطوط سمك الحمار الوحشي الواضحة بصريًا بالتصوير عالي الدقة للتفاعلات بين الورم والبيئة الدقيقة.
ولعل التطبيق الواعد من حمار وحشي كنموذج xenograft هو القدرة على إجراء فحص المخدرات عالية الإنتاجية على عينات السرطان البشري بطريقة غير ممكنة باستخدام أي كائن حي نموذج آخر. تمتص اليرقات الأدوية من الماء عبر الجلد ، مما يعزز سهولة إدارة الدواء5. ولأن الحيوانات تُحتفظ بها في لوحات 96 بئراً، وعادة ما تكون في 100-300 ميكرولتر من المياه، فإن الشاشات تتطلب كميات أدوية أصغر مقارنة بالفئران. حاليا، هناك عدة طرق مختلفة لتوحيد وتقدير تأثير المخدرات على عبء الورم البشري في سمك الحمار الوحشي، وبعضها أكثر عملية من غيرها لتوسيع نطاق اختبار المخدرات واحد إلى فحص عالية الإنتاجية. على سبيل المثال، تقوم بعض المجموعات بفصل الأسماك إلى تعليق خلية واحدة، والقياس الكمي للخلايا السرطانية المسماة أو الملطخة بالفلورسنت عن طريق تصوير قطرات فردية من التعليق وقياس الفلورسيز باستخدام ماكرو ImageJ شبه الآلي4. تم تطوير طريقة تصوير شبه آلية لليرقات الكاملة تم فيها إصلاح أسماك اليرقات في لوحات 96 بئرًا وتصويرها باستخدام مجهر فلوري مقلوب قبل إعادة تنظيم الصور المركبة والقياس الكمي لبؤر الخلايا السرطانية6. كل من هذه المقالات هي أساليب كثيفة العمالة إلى حد ما للقياس الكمي، والتي جعلت حقا فحص المخدرات عالية الإنتاجية في نماذج xenograft سمك الحمار الوحشي غير عملي.
وقد تم تناول هذه المسألة من خلال تطوير التكنولوجيا الخاصة بالفحص الآلي الفقارية (VAST) Bioimages و الجسيمات الكبيرة (LP) العينات ، والمجهر الفلورسينس مجهزة وحدة التصوير والآلي وحدة أخذ العينات(الشكل 1 وجدول المواد)، وهو وسيلة مؤتمتة حقا لتصوير عالية الإنتاجية من يرقات حمار وحشي7،8،9. مع هذه الوحدة ، يتم كشف الأسماك ، أخذ عينات تلقائيًا من لوحة 96 – جيدًا ، يتم وضعها في شعرية وتدويرها في اتجاه المجموعة استنادًا إلى تفضيل المستخدم المحدد مسبقًا ، والصورة ، ثم يتم وضعها مرة أخرى في نفس البئر من لوحة 96-well جديدة لمزيد من الدراسات أو يتم التخلص منها. الجمع بين هذه التكنولوجيا التصوير مع زيوجرافات حمار وحشي قد تسمح لإمكانية الطب الشخصي الذي يستخدم عالية الإنتاجية فحص المخدرات من المكتبات المركبة المخدرات الكبيرة ضد أورام المرضى الفردية. كما تقدم زيينوجرافات حمار وحشي طريقة واسعة النطاق ومنخفضة التكلفة لاختبار كل من سمية وفعالية المركبات الجديدة في الجسم الحي. يمكن استخدام سمك الحمار الوحشي كخطوة فحص أولية قبل الشروع في نماذج xenograft الماوس.
لقد قمنا بتطوير سير عمل مبسط لخلايا سرطان الدم المريض الأولي ة xenografting في حمار وحشي وأداء شاشات المخدرات عالية الإنتاجية مع التصوير الآلي والقياس الكمي، والتي يمكن تطبيقها على أي خلايا الورم المريض الأولية الأخرى أو خط الخلايا السرطانية. استخدم سير العمل هذا مجهر فلورسينس مجهز بوحدة تصوير ووحدة عينات آلية لتحسين طرق التوحيد والقياس الكمي الحالية ويقدم بديلاً آلياً للطرق السابقة الأكثر كثافة في العمل لتحديد كتلة الورم في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، أظهرنا طريقة موحدة لإذابة وحقن خلايا سرطان الدم المريض الأولي في حمار وحشي كنموذج xenograft. كما وضعنا بروتوكولًا لفحص الأدوية عالية الإنتاجية لسمك الحمار الوحشي xenografted باستخدام وحدة تصوير مجهزة بالمجهر الفلوري ووحدة أخذ العينات الآلية. في السابق ، تم الإبلاغ عن xenografts مع خطوط …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل جائزة V Foundation V للباحثين ومنح المعاهد القومية للصحة DP2CA228043 ، R01CA227656 (إلى J.S. Blackburn) وNIH Training Grant T32CA165990 (إلى M.G. Haney).
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
