斑马鱼原发性患者衍生肿瘤异种移植物的药物筛选
Summary
斑马鱼异种移植模型允许在体内微环境中对人类癌细胞进行高通量药物筛选和荧光成像。我们使用配备自动化荧光显微镜的成像单元，为斑马鱼患者衍生白血病样本进行大规模的自动化药物筛查工作流程。
Abstract
患者衍生的异种移植模型对于定义不同癌症对体内系统药物治疗的反应至关重要。小鼠模型是该领域的标准，但斑马鱼已成为具有多种优势的替代模型，包括高通量和低成本药物筛选的能力。斑马鱼还允许在体内进行药物筛选，其复制数量较大，以前只能通过体外系统获得。快速执行大规模药物筛选的能力可能为个性化医学打开可能性，快速将结果翻译回临床。Zebrafish 异种移植模型还可用于根据针对靶向疗法的肿瘤反应快速筛选可操作突变，或从大型库中识别新的抗癌化合物。目前该领域的主要限制是量化和自动化这一过程，以便药物筛选能够更大规模地进行，减少劳动密集型。我们开发了一个工作流程，用于将原发性患者样本移植到斑马鱼幼虫中，并使用配备荧光显微镜的成像单元和自动取样器单元执行大规模药物筛选。该方法使移植肿瘤区域标准化和定量，对大量斑马鱼幼虫的药物治疗有反应。总体而言，该方法比传统细胞培养药物筛选具有优势，因为它允许肿瘤细胞在整个药物治疗过程中在体内环境中生长，并且比小鼠在体内大规模药物筛选中更实用、更经济。
Introduction
将原发性患者癌症或人类癌细胞系异种移植到模型生物体中，是一种广泛应用的技术，用于研究肿瘤进展和体内行为、肿瘤对药物治疗的反应以及癌细胞与微环境的相互作用等。传统上，细胞被异种移植到免疫受损的小鼠中，这仍然是该领域的标准。然而，该模型系统存在几个局限性，如成本高、复制数低、难以准确量化体内肿瘤负担，以及肿瘤移植和药物检测完成时间延长。近年来，斑马鱼已成为替代异种移植模型，第一次报告是在2005年，绿色荧光蛋白（GFP）标记的人类黑色素瘤细胞系移植到胚芽阶段胚胎11，2。2最近，2天受精后（dpf）斑马鱼幼虫已被用作异种移植受体，以控制注射的解剖位置，并在高分辨率内成像肿瘤与周围微环境33，4。4
斑马鱼作为异种移植模型具有许多优点。首先，成年斑马鱼可以以相对较低的成本大量栖息和快速繁殖。每对成斑马鱼每周可以产下数百条幼虫鱼。由于其体积小，这些幼虫斑马鱼可以保存在96孔板，用于高通量药物筛选。幼虫在典型的异种移植实验过程中不必喂食，因为它们的蛋黄囊为它们的第一周的生命提供了维持它们的营养。此外，斑马鱼在7 dpf之前没有功能齐全的免疫系统，这意味着它们不需要在异种移植注射之前进行辐照或免疫抑制疗法。最后，光学清晰的斑马鱼线允许对肿瘤-微环境相互作用进行高分辨率成像。
也许最有希望的应用斑马鱼作为异种移植模型是能够执行高通量药物筛选人类癌症样本的方式，这是不可能使用任何其他模型有机体。Larvae通过皮肤从水中吸收药物，提高药物管理的便利性。由于动物被保存在96孔板中，通常以100~300μL的水，因此与小鼠相比，屏幕所需的药物数量较少。目前，对斑马鱼药物对人类肿瘤负担的影响进行标准化和量化的方法有几种不同，其中一些方法比其它方法更实用，用于将单一药物检测扩展到高通量筛查。例如，一些组分离鱼成单细胞悬浮液，并通过成像悬浮液的单个液滴和使用半自动ImageJ宏4量化荧光来量化荧光标记或染色肿瘤细胞。研制了一种半自动全幼虫成像方法，将幼虫鱼固定在96孔板中，在重新排列合成图像和定量肿瘤细胞体6之前，使用倒置荧光显微镜进行成像。这两种检测都是相当劳动密集型的定量方法，这使得斑马鱼异种移植模型中真正高通量的药物筛选变得不切实际。
这一问题已经通过开发脊椎动物自动筛选技术（VAST）生物成像仪和大粒子（LP）采样器，荧光显微镜配备成像单元和自动取样器单元（图1和材料表），这是一个真正的自动化方法，高通量成像斑马鱼幼虫7,7，8，9。,9有了这个装置，鱼被麻醉，从96孔板自动取样，定位在毛细管中，并根据预设的用户偏好（成像）旋转成设定的方向，然后放回新的96孔板的同一孔中，以便进一步研究或丢弃。将这种成像技术与斑马鱼异种移植相结合，可以实现个性化药物的可能性，这种个性化药物使用大药物化合物库的高通量药物筛选来对抗单个患者肿瘤。斑马鱼异种移植物也提供了一种大规模和低成本的方法，用于测试体内新型化合物的毒性和功效。斑马鱼可以作为初步筛选步骤，然后再进入小鼠异种移植模型。
我们开发了一个简化的工作流程，用于将原发性患者白血病细胞移植到斑马鱼中，并执行高通量药物屏幕，通过自动成像和定量，可应用于任何其他原发性患者肿瘤细胞或癌细胞系。该工作流程利用荧光显微镜配备的成像单元和自动取样器单元，改进了目前的标准化和定量方法，并提供了一种自动化的替代方法，以取代以前更劳动密集型的体内肿瘤质量量化方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这项研究中，我们展示了一种标准化的方法，将原发性患者白血病细胞解冻并注射到斑马鱼中，作为异种移植模型。我们还建立了一个协议，使用荧光显微镜配备成像单元和自动取样器单元，对异种移植斑马鱼进行高通量药物筛选。以前，异种移植物已经报告与人类细胞系，和定量异种移植肿瘤的高通量方式一直是该领域的挑战。该方法作为研究的基础，利用荧光显微镜配备成像单元和自动取?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了V基金会V学者奖和NIH资助DP2CA228043，R01CA227656（J.S.布莱克本）和NIH培训补助金T32CA165990（对M.G.哈尼）的支持。
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
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