Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen
Summary
Zebrafish xenograft modellen zorgen voor high-throughput drug screening en fluorescerende beeldvorming van menselijke kankercellen in een in vivo micro-omgeving. We ontwikkelden een workflow voor grootschalige, geautomatiseerde medicijnscreening op patiënt-afgeleide leukemiemonsters bij zebravissen met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit.
Abstract
Patiënt afgeleide xenograft modellen zijn van cruciaal belang bij het definiëren van hoe verschillende vormen van kanker reageren op medicamenteuze behandeling in een in vivo systeem. Muis modellen zijn de standaard in het veld, maar zebravis zijn ontstaan als een alternatief model met verschillende voordelen, waaronder de mogelijkheid voor high-throughput en low-cost drug screening. Zebravissen maken ook in vivo drug screening met grote repliceren nummers die voorheen alleen verkrijgbaar waren met in vitro systemen. De mogelijkheid om snel uit te voeren grootschalige drug schermen kan openen de mogelijkheid voor gepersonaliseerde geneeskunde met een snelle vertaling van de resultaten terug naar de kliniek. Zebrafish xenograft modellen kunnen ook worden gebruikt om snel te screenen op bruikbare mutaties op basis van tumor respons op gerichte therapieën of om nieuwe anti-kanker verbindingen uit grote bibliotheken te identificeren. De huidige grote beperking in het veld is het kwantificeren en automatiseren van het proces, zodat drug schermen kunnen worden gedaan op grotere schaal en minder arbeidsintensief. We hebben een workflow ontwikkeld voor het xenograften van primaire patiëntmonsters in zebravissenlarven en het uitvoeren van grootschalige drugsschermen met behulp van een met fluorescentiemicroscoop uitgeruste beeldverwerkingseenheid en geautomatiseerde sampler-eenheid. Deze methode maakt standaardisatie en kwantificering van geënte tumorgebied en reactie op de behandeling van geneesmiddelen in grote aantallen zebravissen larven. Over het algemeen is deze methode voordelig ten opzichte van traditionele celkweekmedicijnscreening, omdat het de groei van tumorcellen in een in vivo-omgeving tijdens de behandeling van geneesmiddelen mogelijk maakt en praktischer en kosteneffectiever is dan muizen voor grootschalige in vivo-medicijnschermen.
Introduction
Xenografting van primaire patiëntkankerof menselijke kankercellijnen in modelorganismen is een veel gebruikte techniek om tumorprogressie en gedrag in vivo, tumorreactie op de behandeling van geneesmiddelen en de interactie van kankercellen met de micro-omgeving te bestuderen. Traditioneel worden cellen xenografted in immuun-gecompromitteerde muizen, en dit blijft de standaard in het veld. Dit modelsysteem heeft echter verschillende beperkingen, zoals hoge kosten, lage replicerengetallen, moeilijkheden bij het nauwkeurig kwantificeren van tumorlast in vivo en de langere tijd die het kost om tumoren te laten enten en medicijntests te voltooien. In de afgelopen jaren, zebravis zijn ontstaan als een alternatieve xenograft model, met de eerste wordt gemeld in 2005, met groene fluorescerende eiwitten (GFP) gelabeld menselijke melanoom cellijnen getransplanteerd in blastula-stadium embryo’s1,2. Meer recent, 2 dagen na de bevruchting (dpf) zebravis larven zijn gebruikt als xenograft ontvangers om controle van anatomische locatie van injectie en voor gebruik in hoge resolutie in vivo beeldvorming van tumor interactie met de omringende micro-omgeving3,4.
Zebravissen bieden vele voordelen als een xenograft model. Ten eerste kunnen volwassen zebravis worden gehuisvest en snel worden gekweekt in grote hoeveelheden tegen relatief lage kosten. Elk paar volwassen zebravis kan honderden larvevissen per week produceren. Vanwege hun kleine omvang kunnen deze larve zebravissen worden onderhouden in 96-putplaten voor high-throughput drug screening. Larven hoeven niet te worden gevoed tijdens een typisch xenograft-experiment, omdat hun dooierzak de voedingsstoffen biedt om ze hun eerste week van het leven te ondersteunen. Bovendien hebben zebravissen pas om 7 dpf een volledig functioneel immuunsysteem, wat betekent dat ze geen bestraling of immunosuppressieve regimes nodig hebben voorafgaand aan de xenograft-injectie. Ten slotte zorgen optisch heldere zebravislijnen voor hoge resolutie beeldvorming van tumor-micro-omgeving interacties.
Misschien wel de meest veelbelovende toepassing van zebravissen als een xenograft model is de mogelijkheid om high-throughput drug screening uit te voeren op menselijke kanker monsters op een manier die niet mogelijk is met behulp van een ander model organisme. Larven absorberen medicijnen uit het water via de huid, waardoor het gemak van toediening van geneesmiddelenwordt verbeterd 5. Omdat dieren worden onderhouden in 96-put platen, meestal in 100−300 μL water, schermen vereisen kleinere hoeveelheden drugs in vergelijking met muizen. Momenteel zijn er verschillende methoden voor standaardisatie en kwantificering van het effect van geneesmiddelen op de menselijke tumorlast bij zebravissen, waarvan sommige praktischer zijn dan andere voor het opschalen van enkelvoudige medicijntests tot screening met een hoge doorvoer. Sommige groepen scheiden bijvoorbeeld vis in eencellige suspensie en kwantificeren fluorescerende of gekleurde tumorcellen door individuele druppels van de suspensie te beeldvorming en fluorescentie te kwantificeren met behulp van een semi-geautomatiseerde ImageJ-macro4. Een semi-geautomatiseerde whole-larimaging methode werd ontwikkeld waarin larve vissen werden vastgesteld in 96-put platen en afgebeeld met behulp van een omgekeerde fluorescerende microscoop voor de herschikking van samengestelde beelden en kwantificering van tumorcel foci6. Beide testen zijn vrij arbeidsintensieve methoden voor kwantificering, die heeft gemaakt echt high-throughput drug screening in zebrafish xenograft modellen onpraktisch.
Dit probleem is aangepakt door de ontwikkeling van de Vertebrate Automated Screening Technology (VAST) Bioimager and Large Particle (LP) Sampler, een fluorescentiemicroscoop uitgeruste beeldverwerkingseenheid en geautomatiseerde sampler unit (Figuur 1 en Tabel van Materialen), dat is een echt geautomatiseerde methode voor high-throughput beeldvorming van zebravissen larven7,8,9. Met deze eenheid worden vissen verdoofd, automatisch bemonsterd van een 96-well plaat, gepositioneerd in een capillaire en gedraaid in de ingestelde oriëntatie op basis van een vooraf ingestelde gebruiker voorkeur, afgebeeld, en vervolgens ofwel terug geplaatst in dezelfde put van een nieuwe 96-well plaat voor verdere studies of weggegooid. Het combineren van deze beeldvormende technologie met zebravissen xenografts kan zorgen voor de mogelijkheid van gepersonaliseerde geneeskunde die high-throughput drug screening van grote drug samengestelde bibliotheken tegen individuele patiënt tumoren gebruikt. Zebrafish xenografts bieden ook een grootschalige en goedkope methode voor het testen van zowel toxiciteit en werkzaamheid van nieuwe verbindingen in vivo. Zebravissen kunnen worden gebruikt als een voorlopige screening stap alvorens over te gaan tot muis xenograft modellen.
We hebben een gestroomlijnde workflow ontwikkeld voor xenografting primary patient leukemie cellen in zebravissen en het uitvoeren van high-throughput drug schermen met geautomatiseerde beeldvorming en kwantificering, die kan worden toegepast op elke andere primaire patiënt tumorcellen of kankercelllijn. Deze workflow maakte gebruik van een fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit en geautomatiseerde sampler unit om te verbeteren op de huidige standaardisatie en kwantificering methoden en biedt een geautomatiseerd alternatief voor eerdere, meer arbeidsintensieve methoden voor het kwantificeren van tumormassa in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie demonstreerden we een gestandaardiseerde methode voor ontdooien en injecteren van primaire patiëntenleukemiecellen in zebravissen als xenograft-model. We hebben ook een protocol opgesteld voor high-throughput drug screening van xenografted zebrafish met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit en geautomatiseerde sampler unit. Eerder, xenografts zijn gemeld met menselijke cellijnen, en kwantificering van xenografted tumoren in een high-throughput manier is een uitdaging in het veld. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door een V Foundation V Scholar Award en NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (aan J.S. Blackburn) en NIH Training Grant T32CA165990 (aan M.G. Haney).
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
