जेब्राफिश में प्राथमिक रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर ज़ेनोग्राफ्ट की दवा जांच
Summary
जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा मॉडल वीवो माइक्रोएनवायरमेंट में मानव कैंसर कोशिकाओं की उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और फ्लोरोसेंट इमेजिंग की अनुमति देते हैं। हमने एक स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप लैस इमेजिंग यूनिट का उपयोग करके जेब्राफिश में रोगी-व्युत्पन्न ल्यूकेमिया नमूनों पर बड़े पैमाने पर, स्वचालित दवा स्क्रीनिंग के लिए एक कार्यप्रवाह विकसित किया।
Abstract
रोगी व्युत्पन्न विद्वेष मॉडल कैसे विभिन्न कैंसर एक वीवो प्रणाली में दवा के इलाज का जवाब परिभाषित करने में महत्वपूर्ण हैं। माउस मॉडल क्षेत्र में मानक हैं, लेकिन जेब्राफिश कई फायदों के साथ एक वैकल्पिक मॉडल के रूप में उभरा है, जिसमें उच्च-थ्रूपुट और कम लागत वाली दवा स्क्रीनिंग की क्षमता शामिल है। जेब्राफिश भी बड़ी नकल संख्या है कि पहले केवल इन विट्रो सिस्टम के साथ प्राप्य थे के साथ वीवो दवा स्क्रीनिंग में के लिए अनुमति देते हैं । तेजी से बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीन प्रदर्शन करने की क्षमता क्लिनिक के लिए वापस परिणामों के तेजी से अनुवाद के साथ व्यक्तिगत दवा के लिए संभावना खुल सकती है । ज़ेब्राफिश विद्वेष मॉडल का उपयोग लक्षित उपचारों के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया के आधार पर कार्रवाई योग्य उत्परिवर्तनों के लिए तेजी से स्क्रीन करने या बड़े पुस्तकालयों से नए कैंसर रोधी यौगिकों की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है। क्षेत्र में वर्तमान प्रमुख सीमा मात्रा और प्रक्रिया को स्वचालित किया गया है ताकि दवा स्क्रीन एक बड़े पैमाने पर किया जा सकता है और कम श्रम गहन हो । हमने जेब्राफिश लार्वा में प्राथमिक रोगी नमूनों को जेब्राफ़िश लार्वा में xenografting और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप लैस इमेजिंग यूनिट और स्वचालित पारखी इकाई का उपयोग करके बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक कार्यप्रवाह विकसित किया है। यह विधि एंग्राफ्ड ट्यूमर क्षेत्र के मानकीकरण और मात्राकरण और बड़ी संख्या में जेब्राफिश लार्वा में दवा उपचार के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति देती है। कुल मिलाकर, यह विधि पारंपरिक सेल संस्कृति दवा स्क्रीनिंग पर लाभप्रद है क्योंकि यह दवा उपचार के दौरान वीवो वातावरण में ट्यूमर कोशिकाओं के विकास के लिए अनुमति देता है, और वीवो ड्रग स्क्रीन में बड़े पैमाने पर चूहों की तुलना में अधिक व्यावहारिक और लागत प्रभावी है।
Introduction
प्राथमिक रोगी कैंसर या मॉडल जीवों में मानव कैंसर सेल लाइनों के Xenografting एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक के लिए ट्यूमर प्रगति और वीवो में व्यवहार का अध्ययन, दवा के इलाज के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया, और माइक्रोपर्यावरण के साथ कैंसर सेल बातचीत, दूसरों के बीच है । परंपरागत रूप से, कोशिकाओं को प्रतिरक्षा-समझौता चूहों में xenografted किया जाता है, और यह क्षेत्र में मानक बना हुआ है। हालांकि, इस मॉडल प्रणाली में कई सीमाएं हैं, जैसे कि उच्च लागत, कम दोहराने की संख्या, वीवो में ट्यूमर के बोझ को सही मात्रा में डालने में कठिनाइयां, और ट्यूमर को एन्बेड़ा और दवा परीक्षण पूरा करने में लगने वाला विस्तारित समय। हाल के वर्षों में, जेब्राफिश एक वैकल्पिक विद्वेष मॉडल के रूप में उभरा है, जिसमें पहली बार 2005 में रिपोर्ट किया गया था, जिसमें ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) – लेबल वाली मानव मेलानोमा सेल लाइनें ब्लास्टुला-स्टेज भ्रूण1,,2में प्रत्यारोपित की गई थीं। हाल ही में, इंजेक्शन के शारीरिक स्थान के नियंत्रण के लिए और आसपास के माइक्रोएनवायरमेंट3,,4के साथ ट्यूमर इंटरैक्शन के वीवो इमेजिंग में उच्च संकल्प में उपयोग के लिए अनुनोग्राफ प्राप्तकर्ताओं के रूप में 2 दिन के बाद निषेचन (डीपीएफ) ज़ेब्राफिश लार्वा का उपयोग किया गया है।
जेब्राफिश एक ज़ेनोग्राफ्ट मॉडल के रूप में कई फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, वयस्क ज़ेब्राफिश को अपेक्षाकृत कम लागत पर बड़ी मात्रा में रखे और तेजी से पैदा किया जा सकता है। वयस्क ज़ेब्राफिश की प्रत्येक संभोग जोड़ी प्रति सप्ताह लार्वा मछली के सैकड़ों का उत्पादन कर सकती है। उनके छोटे आकार के कारण, इन लार्वा जेब्राफिश को उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए 96-वेल प्लेटों में बनाए रखा जा सकता है। लार्वा को एक विशिष्ट विद्वेष प्रयोग के दौरान खिलाया जाना नहीं है, क्योंकि उनकी जर्दी-थैली जीवन के अपने पहले सप्ताह के लिए उन्हें बनाए रखने के लिए पोषक तत्व प्रदान करती है। इसके अलावा, जेब्राफिश में 7 डीपीएफ तक पूरी तरह से कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली नहीं है, जिसका अर्थ है कि उन्हें ज़ेनोग्राफ्ट इंजेक्शन से पहले विकिरण या इम्यूनोप्रेसिव रेजीडेंस की आवश्यकता नहीं होती है। अंत में, ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट ज़ेब्राफिश लाइनें ट्यूमर-माइक्रोएनवायरमेंट इंटरैक्शन के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए अनुमति देती हैं।
शायद एक विद्वेष मॉडल के रूप में ज़ेब्राफिश का सबसे आशाजनक अनुप्रयोग मानव कैंसर के नमूनों पर उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग करने की क्षमता है जो किसी अन्य मॉडल जीव का उपयोग करना संभव नहीं है। लार्वा त्वचा के माध्यम से पानी से दवाओं को अवशोषित करता है, जिससे दवा प्रशासन की आसानी को बढ़ाया जाता है5। क्योंकि जानवरों को 96-अच्छी प्लेटों में बनाए रखा जाता है, आमतौर पर 100−300 माइक्रोन पानी में, स्क्रीन को चूहों की तुलना में छोटी दवा मात्रा ओं की आवश्यकता होती है। वर्तमान में, जेब्राफिश में मानव ट्यूमर के बोझ पर दवाओं के प्रभाव के मानकीकरण और मात्राकरण के लिए कई अलग-अलग तरीके हैं, जिनमें से कुछ उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए स्केलिंग-अप एकल दवा परीक्षण के लिए दूसरों की तुलना में अधिक व्यावहारिक हैं। उदाहरण के लिए, कुछ समूह मछली को एकल सेल निलंबन में अलग करते हैं, और निलंबन की व्यक्तिगत बूंदों की इमेजिंग करके फ्लोरोसेंटी लेबल या दाग ट्यूमर कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करते हैं और अर्ध-स्वचालित इमेजजे मैक्रो4का उपयोग करके फ्लोरेसेंस की मात्रा निर्धारित करते हैं। एक अर्ध-स्वचालित संपूर्ण लार्वा इमेजिंग विधि विकसित की गई थी जिसमें लार्वा मछली को 96-अच्छी प्लेटों में तय किया गया था और समग्र छवियों के पुनर्संरेखण और ट्यूमर सेल फोसी6के परिमाणीकरण से पहले एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवि बनाई गई थी। इन परखों के दोनों काफी श्रम-मात्रा के लिए गहन तरीके हैं, जो वास्तव में जेब्राफिश विद्वेष मॉडल अव्यावहारिक में उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग बना दिया है ।
इस मुद्दे को कशेरुकी स्वचालित स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकी (VAST) बायोइमेजर और लार्ज पार्टिकल (एलपी) पारखी, एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप सुसज्जित इमेजिंग यूनिट और स्वचालित पारखी इकाई(चित्रा 1 और, सामग्री की तालिका)के विकास द्वारा संबोधित किया गया है, जो जेब्राफिश लार्वा7,8,89के उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग के लिए वास्तव में एक स्वचालित तरीका है। इस इकाई के साथ, मछली को एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है, एक केशिका में तैनात 96-अच्छी प्लेट से स्वचालित रूप से नमूना लिया जाता है, एक केशिका में तैनात किया जाता है और पूर्व निर्धारित उपयोगकर्ता वरीयता के आधार पर सेट ओरिएंटेशन में घुमाया जाता है, इमेजड, और फिर या तो आगे की पढ़ाई के लिए एक नई 96-अच्छी प्लेट के समान कुएं में वापस रखा जाता है या त्याग दिया जाता है। जेब्राफिश विद्वेष के साथ इस इमेजिंग तकनीक का संयोजन व्यक्तिगत दवा की संभावना के लिए अनुमति दे सकता है जो व्यक्तिगत रोगी ट्यूमर के खिलाफ बड़े दवा यौगिक पुस्तकालयों की उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग का उपयोग करता है। जेब्राफ़िश ज़ेनोग्राफ्ट वीवो में उपन्यास यौगिकों की विषाक्तता और प्रभावकारिता दोनों का परीक्षण करने के लिए एक बड़े पैमाने पर और कम लागत वाली विधि भी प्रदान करते हैं। ज़ेब्राफिश माउस विद्वेष मॉडल के लिए आगे बढ़ने से पहले एक प्रारंभिक स्क्रीनिंग कदम के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
हमने जेब्राफिश में प्राथमिक रोगी ल्यूकेमिया कोशिकाओं को ज़ेनोग्राफिंग करने और स्वचालित इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन के साथ उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीन के प्रदर्शन के लिए एक सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह विकसित किया है, जिसे किसी अन्य प्राथमिक रोगी ट्यूमर कोशिकाओं या कैंसर सेल लाइन पर लागू किया जा सकता है। इस कार्यप्रवाह ने वर्तमान मानकीकरण और मात्राकरण विधियों में सुधार करने के लिए एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप सुसज्जित इमेजिंग यूनिट और स्वचालित पारखी इकाई का उपयोग किया और वीवो में ट्यूमर द्रव्यमान को मात्रा निर्धारित करने के पिछले, अधिक श्रम-गहन तरीकों के लिए एक स्वचालित विकल्प प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हमने एक ज़ेनोबेड़ा मॉडल के रूप में जेब्राफिश में प्राथमिक रोगी ल्यूकेमिया कोशिकाओं के विगलन और इंजेक्शन के लिए एक मानकीकृत विधि का प्रदर्शन किया। हमने फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप लैस इमे?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को वी फाउंडेशन वी स्कॉलर अवार्ड और एनआईएच ग्रांट DP2CA228043, R01CA227656 (J.S. ब्लैकबर्न के लिए) और NIH प्रशिक्षण अनुदान T32CA165990 (एमजी हैनी के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
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