Screening farmacologico del paziente primario - Tumore derivato Xenotrapianto nel pesce zebra
Summary
I modelli di xenotrapianto di pesce zebra consentono lo screening farmacologico ad alto consumo e l’imaging fluorescente delle cellule tumorali umane in un microambiente in vivo. Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per lo screening automatizzato dei farmaci su su larga scala su campioni di leucemia derivati dal paziente nel pesce zebra utilizzando un’unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza automatizzata.
Abstract
I modelli di xenotrapianto derivati dal paziente sono fondamentali per definire il modo in cui i diversi tipi di cancro rispondono al trattamento farmacologico in un sistema in vivo. I modelli murini sono lo standard sul campo, ma il pesce zebra è emerso come un modello alternativo con diversi vantaggi, tra cui la possibilità di alta produttività e screening farmacologico a basso costo. Il pesce zebra consente anche lo screening farmacologico in vivo con un numero elevato di replica che in precedenza erano ottenibili solo con sistemi in vitro. La capacità di eseguire rapidamente schermi di farmaci su larga scala può aprire la possibilità di medicina personalizzata con rapida traduzione dei risultati in clinica. I modelli di xenotrapianto di pesce zebra potrebbero anche essere utilizzati per esaminare rapidamente le mutazioni utilizzabili sulla base della risposta del tumore a terapie mirate o per identificare nuovi composti anti-cancro provenienti da grandi librerie. L’attuale principale limitazione nel campo è stata la quantificazione e l’automazione del processo in modo che gli schermi di droga possano essere eseguiti su scala più ampia ed essere meno laboriosi. Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per lo xenotrapianto di campioni di pazienti primari in larve di pesce zebra ed eseguendo schermi di farmaci su larga scala utilizzando un’unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza e un’unità campionatore automatizzata. Questo metodo consente la standardizzazione e la quantificazione dell’area tumorale innestata e la risposta al trattamento farmacologico in un gran numero di larve di pesce zebra. Nel complesso, questo metodo è vantaggioso rispetto allo screening farmacologico tradizionale della coltura cellulare in quanto consente la crescita delle cellule tumorali in un ambiente in vivo durante il trattamento farmacologico ed è più pratico e conveniente rispetto ai topi per schermi di farmaci in vivo su larga scala.
Introduction
Lo xenotrapianto dei tumori primari dei pazienti primari o delle linee cellulari del cancro umano negli organismi modello è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare la progressione e il comportamento del tumore in vivo, la risposta del tumore al trattamento farmacologico e l’interazione delle cellule tumorali con il microambiente, tra gli altri. Tradizionalmente, le cellule sono xenotrapinged in topi immunocompromessi, e questo rimane lo standard nel campo. Tuttavia, questo sistema modello ha diverse limitazioni, come ad esempio ad alto costo, bassi numeri di replica, difficoltà nel quantificare con precisione il carico tumorale in vivo e il tempo prolungato necessario per il completamento dei tumori e dei test antidroga. Negli ultimi anni, il pesce zebra è emerso come un modello alternativo di xenotrapianto, con il primo segnalato nel 2005, con linee cellulari di cellule di melanoma umano etichettate con proteina fluorescente verde (GFP) trapiantate in embrioni di stadio blastula1,2. Più recentemente, 2 giorni dopo la fecondazione (dpf) larve di pesce zebra sono state utilizzate come destinatari di xenotrapianto per consentire il controllo della posizione anatomica dell’iniezione e per l’uso nell’imaging in vivo ad alta risoluzione dell’interazione tumorale con il microambiente circostante3,4.
Il pesce zebra offre molti vantaggi come modello xenotrapianto. In primo luogo, il pesce zebra adulto può essere alloggiato e rapidamente allevato in grandi quantità ad un costo relativamente basso. Ogni coppia di accoppiamento di pesce zebra adulto può produrre centinaia di pesci larva alla settimana. A causa delle loro piccole dimensioni, questi pesci zebra larva possono essere mantenuti in piastre di 96 pozze per lo screening farmacologico ad alto rendimento. Le larve non devono essere nutrite nel corso di un tipico esperimento di xenotrapianto, poiché il loro tuorlo-sac fornisce i nutrienti per sostenerle per la loro prima settimana di vita. Inoltre, i pesci zebra non hanno un sistema immunitario completamente funzionale fino a 7 dpf, il che significa che non richiedono irradiazione o regimi immunosoppressivi prima dell’iniezione di xenotrapianto. Infine, le linee di pesci zebra otticamente chiare consentono l’imaging ad alta risoluzione delle interazioni tumora-microambiente.
Forse l’applicazione più promettente del pesce zebra come modello di xenotrapianto è la capacità di eseguire screening farmacologico ad alto rendimento su campioni di cancro umano in un modo che non è possibile utilizzando qualsiasi altro organismo modello. Le larve assorbono farmaci dall’acqua attraverso la pelle, migliorando la facilità di somministrazione della droga5. Poiché gli animali sono mantenuti in piastre di 96 pozze, in genere in 100-300 – l of water, gli schermi richiedono quantità di droga più piccole rispetto ai topi. Attualmente, esistono diversi metodi per la standardizzazione e la quantificazione dell’effetto dei farmaci sul carico tumorale umano nel pesce zebra, alcuni dei quali sono più pratici di altri per aumentare il test di singolo farmaco per lo screening ad alto throughput. Ad esempio, alcuni gruppi dissociano i pesci in sospensioni a singola cellula e quantificano le cellule tumorali fluorescenti etichettate o macchiate mediante l’imaging di singole goccioline della sospensione e quantificando la fluorescenza utilizzando una macro ImageJ semi-automatica4. È stato sviluppato un metodo semiautomatico di imaging a larve intere in cui i pesci larvali sono stati fissati in piastre di 96 pozzetti e immagini utilizzando un microscopio fluorescente invertito prima del riallineamento delle immagini composite e della quantificazione dei foci delle cellule tumorali6. Entrambi questi saggi sono metodi abbastanza laboriosi per la quantificazione, che ha reso impraticabili lo screening dei farmaci ad alto consumo nei modelli di xenotrapianto di pesce zebra.
Questo problema è stato affrontato dallo sviluppo del Bioimager And -VAST (Pregerato) Di Vertebrate Automated Screening Technology (VAST), un campionatore di particelle di microscopio a fluorescenza e un’unità campionatore automatizzato (Figura 1 e Tabella dei materiali), che è un metodo veramente automatizzato per l’imaging ad alta velocità delle larve di pesce zebra7,8,9. Con questa unità, i pesci vengono anestesizzati, campionati automaticamente da una piastra di 96 pozzetti, posizionati in un capillare e ruotati nell’orientamento impostato in base a una preferenza utente preimpostata, immagini e quindi riposti nello stesso pozzo di una nuova piastra da 96 pozzetti per ulteriori studi o scartati. La combinazione di questa tecnologia di imaging con xenografti di pesce zebra può consentire la possibilità di una medicina personalizzata che utilizza lo screening farmacologico ad alta produttività di grandi librerie di composti farmacologici contro i tumori dei singoli pazienti. Gli xenograforti di pesce zebra offrono anche un metodo su larga scala e a basso costo per testare sia la tossicità che l’efficacia di nuovi composti in vivo. Il pesce zebra può essere utilizzato come fase di screening preliminare prima di procedere ai modelli di xenotrapianto del topo.
Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro semplificato per lo xenotrapianto delle cellule di leucemia primaria del paziente nel pesce zebra e l’esecuzione di schermi di farmaci ad alta velocità con imaging e quantificazione automatizzati, che possono essere applicati a qualsiasi altra cellula tumorale primaria del paziente o linea cellulare del cancro. Questo flusso di lavoro ha utilizzato un’unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza e un’unità campionatore automatizzata per migliorare gli attuali metodi di standardizzazione e quantificazione e offre un’alternativa automatizzata ai precedenti metodi più laboriosi per quantificare la massa tumorale in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo standardizzato per scongelare e iniezione di cellule leucemiche primarie del paziente nel pesce zebra come modello di xenotrapianto. Abbiamo anche stabilito un protocollo per lo screening farmacologico ad alta produttività del pesce zebra xenotrapianto utilizzando un’unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza e un’unità campionatore automatizzata. In precedenza, gli xenografi sono stati segnalati con linee cellulari umane, e la quantificazione dei tumori xenotr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata da un V Foundation V Scholar Award e NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (a J.S. Blackburn) e NIH Training Grant T32CA165990 (a M.G. Haney).
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
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