Narkotikascreening av primær pasient avledet tumor xenografts i sebrafisk
Summary
Zebrafish xenograft modeller tillate høy gjennomstrømning narkotika screening og fluorescerende avbildning av menneskelige kreftceller i en in vivo mikromiljø. Vi utviklet en arbeidsflyt for storskala, automatisert legemiddelscreening på pasientavledede leukemiprøver i sebrafisk ved hjelp av et automatisert fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet.
Abstract
Pasientavledede xenograftmodeller er avgjørende for å definere hvordan ulike kreftformer reagerer på medikamentell behandling i et in vivo-system. Musemodeller er standarden i feltet, men sebrafisk har dukket opp som en alternativ modell med flere fordeler, inkludert evnen til høy gjennomstrømning og lavpris narkotikascreening. Sebrafisk tillater også in vivo narkotikascreening med store replikeringstall som tidligere bare var oppnåelige med in vitro-systemer. Evnen til raskt å utføre store narkotikaskjermer kan åpne opp muligheten for personlig medisin med rask oversettelse av resultater tilbake til klinikken. Zebrafish xenograft modeller kan også brukes til å raskt screene for handlingsbare mutasjoner basert på tumorrespons på målrettede terapier eller for å identifisere nye anti-kreft forbindelser fra store biblioteker. Den nåværende store begrensningen i feltet har vært å kvantifisere og automatisere prosessen slik at narkotikaskjermer kan gjøres i større skala og være mindre arbeidskrevende. Vi har utviklet en arbeidsflyt for xenografting primære pasientprøver i sebrafisk larver og utføre store narkotika skjermer ved hjelp av en fluorescens mikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert sampler enhet. Denne metoden gjør det mulig for standardisering og kvantifisering av enpodet tumorområde og respons på narkotikabehandling på tvers av et stort antall sebrafisklarver. Samlet sett er denne metoden en fordel fremfor tradisjonell cellekultur medikamentscreening, da det gir mulighet for vekst av tumorceller i et in vivo-miljø gjennom narkotikabehandling, og er mer praktisk og kostnadseffektiv enn mus for store in vivo-legemiddelskjermer.
Introduction
Xenografting av primærpasientkreft eller menneskelige kreftcellelinjer i modellorganismer er en mye brukt teknikk for å studere tumorprogresjon og atferd in vivo, tumorrespons på narkotikabehandling og kreftcelleinteraksjon med mikromiljøet, blant andre. Tradisjonelt er celler xenografted til immunkompromitterte mus, og dette er fortsatt standarden i feltet. Dette modellsystemet har imidlertid flere begrensninger, for eksempel høye kostnader, lave replikeringstall, vanskeligheter med nøyaktig kvantifiserende tumorbyrde in vivo, og den utvidede tiden det tar for svulster å engraft og narkotikatesting som skal fullføres. I de senere årene har sebrafisk dukket opp som en alternativ xenograft modell, med den første som ble rapportert i 2005, med grønt fluorescerende protein (GFP)-merket humant melanom cellelinjer transplantert inn blastula-stadium embryoer1,2. Mer nylig, 2 dagers post-befruktning (dpf) sebrafisk larver har blitt brukt som xenograft mottakere for å tillate kontroll av anatomisk injeksjonssted og for bruk i høy oppløsning in vivo avbildning av tumorinteraksjon med det omkringliggende mikromiljøet3,4.
Zebrafish tilbyr mange fordeler som en xenograft modell. For det første kan voksen sebrafisk plasseres og raskt avlet i store mengder til en relativt lav pris. Hvert par voksne sebrafisk kan produsere hundrevis av larvefisk per uke. På grunn av sin lille størrelse kan disse larvesebrafiskenopprettholdes i 96-brønnplater for høy gjennomstrømning av narkotikascreening. Larver trenger ikke å bli matet i løpet av et typisk xenografteksperiment, da deres eggeplommesekk gir næringsstoffene for å opprettholde dem i sin første uke av livet. Videre har sebrafisk ikke et fullt funksjonelt immunsystem før 7 dpf, noe som betyr at de ikke krever bestråling eller immunsuppressive regimer før xenograft injeksjon. Til slutt, optisk klare sebrafisk linjer tillate høyoppløselig avbildning av tumor-mikromiljø interaksjoner.
Kanskje den mest lovende anvendelsen av sebrafisk som en xenograft modell er evnen til å utføre høy gjennomstrømning narkotika screening på menneskelige kreftprøver på en måte som ikke er mulig å bruke noen annen modell organisme. Larver absorberer stoffer fra vannet gjennom huden, og forbedrer brukervennligheten av legemiddeladministrasjon5. Fordi dyr vedlikeholdes i 96-brønnplater, vanligvis i 100-300 μL vann, krever skjermer mindre legemiddelmengder sammenlignet med mus. For tiden er det flere forskjellige metoder for standardisering og kvantifisering av effekten av legemidler på menneskelig tumorbyrde i sebrafisk, hvorav noen er mer praktiske enn andre for skalering av enkeltnarkotikatesting til høy gjennomstrømningsscreening. For eksempel, noen grupper dissosiere fisk i encellede suspensjoner, og kvantifisere fluorescerende merkede eller farget tumorceller ved å bilde individuelle dråper av suspensjon og kvantifisere fluorescens ved hjelp av en semi-automatisert ImageJ makro4. En halvautomatisert hellarver bildemetode ble utviklet der larvefisk ble festet i 96-brønnplater og avbildet ved hjelp av et omvendt fluorescerende mikroskop før omstilling av sammensatte bilder og kvantifisering av tumorcellefoci6. Begge disse påstandene er ganske arbeidsintensive metoder for kvantifisering, noe som har gjort virkelig høy gjennomstrømning narkotika screening i sebrafisk xenograft modeller upraktisk.
Dette problemet har blitt løst av utviklingen av Vertebrate Automated Screening Technology (VAST) Bioimager og Large Particle (LP) Sampler, et fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert sampler enhet (Figur 1 og Table of Materials), som er en virkelig automatisert metode for høy gjennomstrømning bildebehandling av sebrafisk larver7,,8,9. Med denne enheten blir fisk bedøvet, samplet automatisk fra en 96-brønnplate, plassert i en kapillær og rotert inn i den innstilte retningen basert på en forhåndsinnstilt brukerpreferanse, avbildet, og deretter enten plassert tilbake i samme brønn av en ny 96-brønnplate for videre studier eller kassert. Kombinere denne bildeteknologi med sebrafisk xenografts kan tillate muligheten for personlig medisin som bruker høy gjennomstrømning narkotika screening av store stoffet sammensatte biblioteker mot individuelle pasientsvulster. Sebrafisk xenografts tilbyr også en storskala og rimelig metode for testing av både toksisitet og effekt av nye forbindelser in vivo. Sebrafisk kan brukes som et foreløpig screeningtrinn før du går videre til mus xenograft modeller.
Vi har utviklet en strømlinjeformet arbeidsflyt for xenografting primære pasient leukemi celler i sebrafisk og utføre høy gjennomstrømning narkotika skjermer med automatisert bildebehandling og kvantifisering, som kan brukes på andre primære pasient tumorceller eller kreft celle linje. Denne arbeidsflyten benyttet en fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert samplerenhet for å forbedre på gjeldende standardiserings- og kvantifiseringsmetoder og tilbyr et automatisert alternativ til tidligere, mer arbeidsintensive metoder for kvantifiserende tumormasse in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien demonstrerte vi en standardisert metode for tining og injeksjon av primære pasientleukemiceller i sebrafisk som en xenograftmodell. Vi etablerte også en protokoll for høy gjennomstrømning serutt screening av xenografted sebrafisk ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert sampler enhet. Tidligere har xenografts blitt rapportert med menneskelige cellelinjer, og kvantifisering av xenografted svulster på en høy gjennomstrømning måte har vært en utfordring i feltet. Denne…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av en V Foundation V Scholar Award og NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (til J.S. Blackburn) og NIH Training Grant T32CA165990 (til M.G. Haney).
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
