Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish
Summary
Modelos de xenoenxerto de zebrafish permitem a triagem de medicamentos de alto risco e imagens fluorescentes de células cancerígenas humanas em um microambiente in vivo. Desenvolvemos um fluxo de trabalho para a triagem de medicamentos automatizados em larga escala em amostras de leucemia derivada do paciente em zebrafish usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência automatizada.
Abstract
Os modelos de xenoenxerto derivados do paciente são fundamentais na definição de como diferentes cânceres respondem ao tratamento medicamentoso em um sistema in vivo. Os modelos de mouse são o padrão no campo, mas os zebrafish surgiram como um modelo alternativo com várias vantagens, incluindo a capacidade de alta taxa de entrega e triagem de medicamentos de baixo custo. Os zebrafish também permitem a triagem de medicamentos in vivo com grandes números de réplicas que antes só eram obtidos com sistemas in vitro. A capacidade de realizar rapidamente telas de medicamentos em larga escala pode abrir a possibilidade de medicina personalizada com rápida tradução dos resultados de volta à clínica. Modelos de xenoenxerto de zebrafish também poderiam ser usados para testar rapidamente mutações acionáveis com base na resposta do tumor a terapias-alvo ou para identificar novos compostos anticancerígenos de grandes bibliotecas. A maior limitação atual no campo vem quantificando e automatizando o processo para que as telas de drogas possam ser feitas em uma escala maior e serem menos trabalhosas. Desenvolvemos um fluxo de trabalho para xenoenxeragem de amostras primárias de pacientes em larvas de zebrafish e realizando telas de drogas em larga escala usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência e unidade de amostragem automatizada. Este método permite a padronização e quantificação da área tumoral enxertada e a resposta ao tratamento medicamentoso em grande número de larvas de zebrafish. No geral, este método é vantajoso em relação ao rastreamento de drogas de cultura celular tradicional, pois permite o crescimento de células tumorais em um ambiente in vivo durante todo o tratamento medicamentoso, e é mais prático e econômico do que os camundongos para telas de drogas in vivo em larga escala.
Introduction
O xenoenxerto de cânceres primários ou linhas de células cancerígenas humanas em organismos modelo é uma técnica amplamente utilizada para estudar a progressão e o comportamento do tumor in vivo, a resposta tumoral ao tratamento medicamentoso e a interação celular do câncer com o microambiente, entre outros. Tradicionalmente, as células são xenoenxertadas em camundongos imunocomprometidos, e isso continua sendo o padrão no campo. No entanto, este sistema modelo tem várias limitações, como alto custo, baixonúmero de réplicas, dificuldades em quantificar com precisão a carga tumoral in vivo, e o tempo prolongado que leva para que os tumores se enebrem e os testes medicamentosos sejam concluídos. Nos últimos anos, os zebrafish emergiram como um modelo alternativo de xenoenxerto, com o primeiro sendo relatado em 2005, com linhas de células de melanoma humano rotuladas como proteína sumária verde (GFP) transplantadas em embriões em estágio de blastula1,2. Mais recentemente, larvas de zebrafish pós-fertilização (dpf) de 2 dias têm sido utilizadas como receptores de xenoenxerto para permitir o controle da localização anatômica da injeção e para uso em imagens in vivo de alta resolução da interação tumoral com o microambiente circundante3,4.
Zebrafish oferecem muitas vantagens como modelo de xenoenxerto. Primeiro, os zebrafish adultos podem ser alojados e rapidamente criados em grandes quantidades a um custo relativamente baixo. Cada par de zebrafish adultos pode produzir centenas de peixes larvais por semana. Devido ao seu pequeno tamanho, esses zebrafish larvas podem ser mantidos em placas de 96 poços para triagem de drogas de alto desempenho. As larvas não devem ser alimentadas durante um experimento típico de xenoenxerto, pois sua gema-saca fornece os nutrientes para sustentá-las durante sua primeira semana de vida. Além disso, os zebrafish não têm um sistema imunológico totalmente funcional até 7 dpf, o que significa que eles não requerem irradiação ou regimes imunossupressores antes da injeção de xenoenxerto. Finalmente, linhas de zebrafish opticamente claras permitem imagens de alta resolução de interações tumorais-microambientes.
Talvez a aplicação mais promissora do zebrafish como modelo de xenoenxerto seja a capacidade de realizar o rastreamento de drogas de alto rendimento em amostras de câncer humano de uma maneira que não é possível usando qualquer outro organismo modelo. As larvas absorvem drogas da água através da pele, aumentando a facilidade da administração de medicamentos5. Como os animais são mantidos em placas de 96 poços, tipicamente em 100-300 μL de água, as telas requerem quantidades menores de drogas em comparação com os camundongos. Atualmente, existem vários métodos diferentes para padronização e quantificação do efeito de drogas sobre a carga tumoral humana em zebrafish, alguns dos quais são mais práticos do que outros para escalar testes de drogas individuais para rastreamento de alto desempenho. Por exemplo, alguns grupos dissociam os peixes em suspensões unicelulares e quantificam as células tumorais rotuladas ou manchadas fluorescentemente por imagens individuais de gotículas da suspensão e quantificando fluorescência usando uma macro ImageJ semi-automatizada. Foi desenvolvido um método semi-automatizado de imagem de larvas inteiras em que os peixes larvais foram fixados em placas de 96 poços e imagem usando um microscópio fluorescente invertido antes do realinhamento de imagens compostas e quantificação de focos de células tumorais6. Ambos os ensaios são métodos bastante intensivos em trabalho para quantificação, o que tornou impraticável a triagem de drogas de alto desempenho em modelos de xenoenxerto de zebrafish.
Esta questão foi abordada pelo desenvolvimento da Tecnologia de Triagem Automatizada de Vertebrados (VAST) Bioimager and Large Particle (LP) Sampler, uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência e unidade de amostragem automatizada(Figura 1 e Tabela de Materiais),que é um método verdadeiramente automatizado para imagens de alto throughput de larvas de zebrafish7,8,9. Com esta unidade, os peixes são anestesiados, amostrados automaticamente a partir de uma placa de 96 poços, posicionados em um capilar e girados para a orientação do conjunto com base em uma preferência de usuário predefinida, imagem, e, em seguida, colocados de volta no mesmo poço de uma nova placa de 96 poços para estudos adicionais ou descartados. A combinação desta tecnologia de imagem com os xenoenxertos de zebrafish pode permitir a possibilidade de uma medicina personalizada que usa a triagem de medicamentos de alto nível de grandes bibliotecas de compostos medicamentosos contra tumores individuais de pacientes. Os xenoenxertos de zebrafish também oferecem um método de grande escala e baixo custo para testar tanto a toxicidade quanto a eficácia de novos compostos in vivo. Zebrafish pode ser usado como um passo de triagem preliminar antes de prosseguir para modelos de xenoenxerto de rato.
Desenvolvemos um fluxo de trabalho simplificado para xenoenxerção de células de leucemia primárias em zebrafish e realizando telas de medicamentos de alto rendimento com imagens e quantificação automatizadas, que podem ser aplicadas a qualquer outra célula tumoral primária do paciente ou linha celular cancerosa. Este fluxo de trabalho utilizou uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência e uma unidade de amostragem automatizada para melhorar os métodos atuais de padronização e quantificação e oferece uma alternativa automatizada aos métodos anteriores e mais intensivos em mão-de-obra para quantificar a massa tumoral in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, demonstramos um método padronizado para descongelamento e injeção de células primárias de leucemia em zebrafish como modelo de xenoenxerto. Também estabelecemos um protocolo para a triagem de drogas de alto custo de peixe-zebra xenoenxertado usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência e unidade de amostragem automatizada. Anteriormente, os xenoenxertos foram relatados com linhas de células humanas, e a quantificação de tumores xenografados de forma de alto nível tem si…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por um V Foundation V Scholar Award e NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (para J.S. Blackburn) e NIH Training Grant T32CA165990 (para M.G. Haney).
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
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