Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш
Summary
Модели ксенотранспланта зебрафиш позволяют проводить скрининг с высокой пропускной мощностью и флуоресцентную визуализацию раковых клеток человека в микроокружении in vivo. Мы разработали рабочий процесс для крупномасштабного, автоматизированного скрининга лекарственных средств на образцах лейкемии, полученных от пациента, у зебры с помощью автоматизированного флуоресцентного микроскопа, оборудованного блоком визуализации.
Abstract
Пациент производные модели ксенотрансплантата имеют решающее значение в определении того, как различные виды рака реагируют на лечение наркотиками в системе in vivo. Мыши модели являются стандартом в этой области, но зебрафиш стали альтернативной моделью с рядом преимуществ, в том числе возможность высокой пропускной способности и недорогих наркотиков скрининга. Зебрафиш также позволяют для in vivo скрининга наркотиков с большими номерами репликации, которые ранее были доступны только с системами in vitro. Возможность быстро выполнять крупномасштабные экраны наркотиков может открыть возможность для персонализированной медицины с быстрым переводом результатов обратно в клинику. Модели ксенотрансплантата зебрафиш также могут быть использованы для быстрого скрининга на действия мутаций на основе реакции опухоли на целевую терапию или для выявления новых противораковых соединений из крупных библиотек. В настоящее время основным ограничением в этой области является количественное и автоматизация процесса, с тем чтобы экраны наркотиков можно было сделать в более широком масштабе и быть менее трудоемким. Мы разработали рабочий процесс для ксенотрансплантации первичных образцов пациентов в личинки зебры и выполнения крупномасштабных экранов наркотиков с помощью флуоресцентного микроскопа оборудованный блок визуализации и автоматизированный блок сэмплер. Этот метод позволяет стандартизировать и количественно привязать область опухоли и ответ на медикаментозное лечение в большом количестве личинок зебры. В целом, этот метод является выгодным по сравнению с традиционной клеточной культуры скрининга наркотиков, как это позволяет для роста опухолевых клеток в среде in vivo на протяжении всего лечения наркотиками, и является более практичным и экономически эффективным, чем мышей для крупномасштабных in vivo наркотиков экранов.
Introduction
Xenografting первичных раковых заболеваний пациента или раковых клеток человека линий в модель организмов является широко используемым методом для изучения прогрессирования опухоли и поведения in vivo, реакция опухоли на лечение наркотиков, и взаимодействие раковых клеток с микросредой, среди других. Традиционно, клетки ксенопригватом в иммунно-компрометированных мышей, и это остается стандартом в этой области. Тем не менее, эта модельная система имеет ряд ограничений, таких как высокая стоимость, низкие цифры репликации, трудности в точной количественной опухолевой нагрузки in vivo, и длительное время, которое требуется для опухолей, чтобы привить и тестирование на наркотики, которые должны быть завершены. В последние годы, зебравый стали альтернативной модели ксенотрансплантата, с первым сообщается в 2005 году, с зеленым флуоресцентным белком (GFP) помечены человеческой меланомы клеточных линий пересажены в бластулы стадии эмбрионов1,2. Совсем недавно, 2 дня после оплодотворения (dpf) личинки зебры были использованы в качестве получателей ксенотрансплантата, чтобы обеспечить контроль анатомического расположения инъекций и для использования в высоком разрешении in vivo изображений взаимодействия опухоли с окружающей микросредой3,4.
Зебрафиш предлагает много преимуществ в качестве модели ксенотрансплантата. Во-первых, взрослых зебры можно разместить и быстро разводить в больших количествах по относительно низкой цене. Каждая пара взрослых зебр ы может производить сотни личинок рыбы в неделю. Из-за их небольшого размера, эти личинки зебры могут быть сохранены в 96-колодцев для высокой пропускной связи наркотиков скрининга. Larvae не должны быть поданы в ходе типичного эксперимента ксенотрансплантата, так как их желток-мешок обеспечивает питательные вещества для поддержания их в течение первой недели жизни. Кроме того, зебрафиш не имеют полностью функциональной иммунной системы до 7 dpf, а это означает, что они не требуют облучения или иммуносупрессивных схем до инъекции ксенотрансплантата. Наконец, оптически четкие линии зебры позволяют с высоким разрешением изображения опухолево-микроэкологических взаимодействий.
Возможно, наиболее перспективным применением зебры в качестве модели ксенотрансплантата является способность выполнять высокопроизводительный скрининг наркотиков на образцах рака человека таким образом, что это невозможно с помощью любого другого модельного организма. Larvae поглощают наркотики из воды через кожу, повышая легкость введения препарата5. Поскольку животные поддерживаются в 96-колодцах, как правило, в 100-300 л воды, экраны требуют меньших количеств наркотиков по сравнению с мышами. В настоящее время существует несколько различных методов стандартизации и количественной оценки влияния препаратов на бремя опухолей человека у зебры, некоторые из которых являются более практичными, чем другие, для масштабирования одного тестирования на наркотики для скрининга с высокой пропускной стоимостью. Например, некоторые группы разъединяют рыбу на одноклеточные суспензии и количественно флуоресцентно помечены или окрашенные опухолевые клетки путем визуализации отдельных капель подвески и количественной флуоресценции с помощью полуавтоматическогоМакро-4ImageJ . Полуавтоматический метод визуализации цельноликов был разработан, в котором личиночные рыбы были зафиксированы в 96-колодцах пластин и изображены с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа перед перегруппировкой композитных изображений и количественной оценкой очагов опухолевых клеток6. Оба эти анализы являются довольно трудоемкими методами количественной оценки, которая сделала действительно высокой пропускной способ скрининга наркотиков в модели ксенотрансплантата зебра непрактично.
Этот вопрос был решен в результате разработки Vertebrate Автоматизированная технология скрининга (VAST) Bioimager и большой частицы (LP) Sampler, флуоресценция микроскоп оборудованный блок визуализации и автоматизированный блок сэмплер (Рисунок 1 и таблица материалов), который является действительно автоматизированным методом для высокой пропускной записи личинки зебры7,8,9. С помощью этого устройства, рыбы под анестетом, взяты автоматически из 96-колодец пластины, расположенные в капилляре и вращается в набор ориентации на основе заданных предпочтений пользователя, изображения, а затем либо помещены обратно в тот же колодец нового 96-ну пластины для дальнейших исследований или отбрасываются. Сочетание этой технологии визуализации с зебрафиш ксенотрансплантатов может позволить возможность персонализированной медицины, которая использует высокой пропускной связи скрининга наркотиков крупных библиотек соединения наркотиков против отдельных опухолей пациента. Кенотранспланты зебрафиш также предлагают крупномасштабный и недорогой метод для проверки токсичности и эффективности новых соединений in vivo. Зебрафиш может быть использован в качестве предварительного шага скрининга, прежде чем приступить к мыши ксенотрансплантат модели.
Мы разработали обтекаемый рабочий процесс для ксенотрансплантации первичных клеток лейкемии пациента в зебрафиш и выполнения высокой пропускной записи наркотиков экраны с автоматизированной визуализации и количественной оценки, которые могут быть применены к любой другой первичной опухолевых клеток пациента или раковой линии клеток. Этот рабочий процесс использовал флуоресцентный микроскоп оборудованный блок визуализации и автоматизированный блок сэмплердля для улучшения текущих методов стандартизации и количественной оценки и предлагает автоматизированную альтернативу предыдущим, более трудоемким методам количественной оценки опухолевой массы in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы продемонстрировали стандартизированный метод оттаивания и инъекции первичных клеток лейкемии пациента в зебрафиш в качестве модели ксенотрансплантата. Мы также установили протокол для высокой пропускной записи наркотиков скрининга ксенотрансвированных зебр…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано V Фонд V Стипендиат премии и NIH Гранты DP2CA228043, R01CA227656 (J.S. Блэкберн) и NIH Обучение Грант T32CA165990 (М.Г. Хэйни).
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
