Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra
Summary
Los modelos de xenoinjerto de pez cebra permiten la detección de fármacos de alto rendimiento y la toma de imágenes fluorescentes de células cancerosas humanas en un microambiente in vivo. Desarrollamos un flujo de trabajo para la detección automatizada de fármacos a gran escala en muestras de leucemia derivadas del paciente en peces cebra utilizando una unidad de imágenes automatizada equipada con microscopio de fluorescencia.
Abstract
Los modelos de xenoinjertos derivados del paciente son fundamentales para definir cómo los diferentes tipos de cáncer responden al tratamiento farmacológico en un sistema in vivo. Los modelos de ratón son el estándar en el campo, pero el pez cebra ha surgido como un modelo alternativo con varias ventajas, incluyendo la capacidad de detección de drogas de alto rendimiento y bajo costo. El pez cebra también permite la detección in vivo de fármacos con grandes números de réplica que antes solo se pueden obtener con sistemas in vitro. La capacidad de realizar rápidamente pantallas de medicamentos a gran escala puede abrir la posibilidad de medicina personalizada con una traducción rápida de los resultados a la clínica. Los modelos de xenoinjerto de pez cebra también podrían utilizarse para detectar rápidamente mutaciones procesables basadas en la respuesta tumoral a terapias dirigidas o para identificar nuevos compuestos contra el cáncer de grandes bibliotecas. La principal limitación actual en el campo ha sido cuantificar y automatizar el proceso para que las pantallas de drogas se puedan hacer a mayor escala y sean menos laboriosas. Hemos desarrollado un flujo de trabajo para las muestras de pacientes primarios de xenografting en larvas de peces cebra y la realización de pantallas de fármacos a gran escala utilizando una unidad de imágenes equipada con microscopio de fluorescencia y una unidad de toma de muestras automatizada. Este método permite la estandarización y cuantificación del área tumoral injertada y la respuesta al tratamiento farmacológico a través de un gran número de larvas de pez cebra. En general, este método es ventajoso sobre la detección de drogas de cultivo celular tradicional, ya que permite el crecimiento de células tumorales en un entorno in vivo durante todo el tratamiento farmacológico, y es más práctico y rentable que los ratones para pantallas de fármacos in vivo a gran escala.
Introduction
La xenografting de cánceres de pacientes primarios o líneas celulares de cáncer humano en organismos modelo es una técnica ampliamente utilizada para estudiar la progresión y el comportamiento del tumor in vivo, la respuesta tumoral al tratamiento farmacológico y la interacción de las células cancerosas con el microambiente, entre otros. Tradicionalmente, las células se xenojeran en ratones inmunes, y esto sigue siendo el estándar en el campo. Sin embargo, este sistema modelo tiene varias limitaciones, tales como alto costo, números de réplica bajos, dificultades para cuantificar con precisión la carga tumoral in vivo, y el tiempo prolongado que tardan los tumores en injertar y pruebas de drogas para completarse. En los últimos años, el pez cebra ha surgido como un modelo de xenoinjerto alternativo, y el primero se ha informado en 2005, con líneas celulares de melanoma humano etiquetadas con proteínafluorescentes verdes (GFP) trasplantadas en embriones de fase de blastula1,,2. Más recientemente, se han utilizado como receptores de xenoinjerto 2 días larvas de pez cebra después de la fertilización (dpf) para permitir el control de la ubicación anatómica de la inyección y para su uso en alta resolución in vivo de la interacción tumoral con el microambiente circundante3,4.
Zebrafish ofrece muchas ventajas como modelo de xenoinjerto. En primer lugar, el pez cebra adulto puede ser alojado y criado rápidamente en grandes cantidades a un costo relativamente bajo. Cada par de peces cebra adultos puede producir cientos de peces laricos por semana. Debido a su pequeño tamaño, estos peces cebra larvales se pueden mantener en placas de 96 pocillos para el cribado de drogas de alto rendimiento. Las larvas no tienen que ser alimentadas durante el transcurso de un experimento típico de xenoinjerto, ya que su saco de yema proporciona los nutrientes para sostenerlas durante su primera semana de vida. Además, el pez cebra no tiene un sistema inmunitario completamente funcional hasta 7 dpf, lo que significa que no requieren irradiación o regímenes inmunosupresores antes de la inyección de xenoinjerto. Por último, las líneas ópticamente claras del pez cebra permiten imágenes de alta resolución de las interacciones tumor-microambiente.
Tal vez la aplicación más prometedora del pez cebra como modelo de xenoinjerto es la capacidad de realizar pruebas de detección de fármacos de alto rendimiento en muestras de cáncer humano de una manera que no es posible utilizando ningún otro organismo modelo. Las larvas absorben los fármacos del agua a través de la piel, mejorando la facilidad de administración de fármacos5. Debido a que los animales se mantienen en placas de 96 pocillos, por lo general en 100 a 300 l de agua, las pantallas requieren cantidades de fármacos más pequeñas en comparación con los ratones. Actualmente, existen varios métodos diferentes para la estandarización y cuantificación del efecto de los medicamentos en la carga tumoral humana en el pez cebra, algunos de los cuales son más prácticos que otros para ampliar las pruebas de un solo fármaco a la detección de alto rendimiento. Por ejemplo, algunos grupos disocian los peces en suspensiones de una sola célula y cuantifican las células tumorales etiquetadas fluorescentes o teñidas mediante la toma de imágenes de gotas individuales de la suspensión y la cuantificación de la fluorescencia utilizando unamacro4 semiautomática de ImageJ. Se desarrolló un método de imagen semiautomática de larvas enteras en el que los peces larvales se fijaban en placas de 96 pocillos e imágenes utilizando un microscopio fluorescente invertido antes de la realineación de imágenes compuestas y la cuantificación de los focos de células tumorales6. Ambos ensayos son métodos bastante intensivos en mano de obra para la cuantificación, lo que ha hecho que el cribado de fármacos de alto rendimiento en modelos de xenoinjerto de pez cebra no sea práctico.
Este problema ha sido abordado por el desarrollo de la Tecnología de Detección Automatizada de Vertebrados (VAST) Bioimagen y Gran Partícula (LP) Sampler, una unidad de imagen equipada con microscopio de fluorescencia y unidad de toma de muestras automatizada(Figura 1 y Tabla de Materiales),que es un método verdaderamente automatizado para la toma de imágenes de alto rendimiento de larvas de pez cebra7,8,9. Con esta unidad, los peces son anestesiados, muestreados automáticamente desde una placa de 96 pocillos, colocados en un capilar y girados en la orientación del conjunto en función de una preferencia de usuario preestablecida, imágenes, y luego colocados de nuevo en el mismo pozo de una nueva placa de 96 pocillos para estudios posteriores o desechados. La combinación de esta tecnología de imágenes con xenoinjertos de pez cebra puede permitir la posibilidad de una medicina personalizada que utilice pruebas de detección de fármacos de alto rendimiento de grandes bibliotecas de compuestos farmacológicos contra tumores de pacientes individuales. Los xenoinjertos de pez cebra también ofrecen un método a gran escala y de bajo costo para probar tanto la toxicidad como la eficacia de nuevos compuestos in vivo. Zebrafish se puede utilizar como paso de cribado preliminar antes de proceder a los modelos de xenoinjerto de ratón.
Hemos desarrollado un flujo de trabajo simplificado para las células de leucemia primaria del paciente de xenografting en el pez cebra y la realización de pantallas farmacológicas de alto rendimiento con imágenes y cuantificación automatizadas, que se pueden aplicar a cualquier otra célula tumoral de paciente primario o línea celular cancerosa. Este flujo de trabajo utilizó una unidad de imágenes equipada con microscopio de fluorescencia y una unidad de tomadegador automatizada para mejorar los métodos actuales de estandarización y cuantificación y ofrece una alternativa automatizada a los métodos anteriores, más intensivos en mano de obra, de cuantificar la masa tumoral in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, demostramos un método estandarizado para la descongelación y la inyección de células de leucemia de pacientes primarios en el pez cebra como modelo de xenoinjerto. También establecimos un protocolo para el cribado de fármacos de alto rendimiento de peces cebra xenoinjerados utilizando una unidad de imágenes equipada con microscopio de fluorescencia y una unidad de toma de muestras automatizada. Anteriormente, se han notificado xenoinjertos con líneas celulares humanas, y la cuantificación de tum…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por un V Foundation V Scholar Award y NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (a J.S. Blackburn) y NIH Training Grant T32CA165990 (a M.G. Haney).
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
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