Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması
Summary
Zebrabalığı ksenogreft modelleri, in vivo mikroortamda yüksek üretimli ilaç taraması ve insan kanser hücrelerinin floresan görüntülemesini sağlar. Zebra balığında hasta kaynaklı lösemi örnekleri üzerinde otomatik floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi kullanılarak büyük ölçekli, otomatik ilaç taraması için bir iş akışı geliştirdik.
Abstract
Hasta türetilmiş ksenogreft modelleri, farklı kanserlerin in vivo bir sistemde ilaç tedavisine nasıl tepki verecek lerini tanımlamada kritik öneme karşıdır. Fare modelleri alanında standart, ancak zebra balığı çeşitli avantajları ile alternatif bir model olarak ortaya çıkmıştır, yüksek üretim ve düşük maliyetli ilaç tarama yeteneği de dahil olmak üzere. Zebrabalığı da daha önce sadece in vitro sistemleri ile elde edildi büyük çoğaltma numaraları ile in vivo ilaç tarama için izin verir. Hızlı bir şekilde büyük ölçekli ilaç ekranları gerçekleştirmek için yeteneği geri kliniğe sonuçların hızlı çevirisi ile kişiselleştirilmiş tıp için olasılık açılabilir. Zebrabalığı ksenogreft modelleri de hızla hedeflenen tedavilere tümör yanıtı dayalı eyleme mutasyonlar için tarama veya büyük kütüphanelerden yeni anti-kanser bileşikleri belirlemek için kullanılabilir. Bu alandaki mevcut büyük sınırlama, ilaç ekranların daha büyük ölçekte yapılabilecek ve daha az emek yoğun hale getirilebilmek için süreci nicelleştirmekte ve otomatikleştirmekte verilmiştir. Birincil hasta örneklerini zebrabalığı larvalarına dönüştürmek ve floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesi kullanarak büyük ölçekli ilaç ekranları gerçekleştirmek için bir iş akışı geliştirdik. Bu yöntem, engrafted tümör alanının standardizasyonu ve nice sayıda zebra balığı larvası arasında ilaç tedavisine yanıt lanmasına olanak sağlar. Genel olarak, bu yöntem geleneksel hücre kültürü ilaç taraması üzerinde avantajlı ilaç tedavisi boyunca bir in vivo ortamda tümör hücrelerinin büyümesine olanak sağlar, ve vivo ilaç ekranlarında büyük ölçekli fareler daha pratik ve maliyet-etkin.
Introduction
Model organizmalar içine primer hasta kanserleri veya insan kanser hücresi hatları xenografting in vivo tümör progresyonu ve davranışını incelemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir, ilaç tedavisine tümör yanıtı, ve mikroçevre ile kanser hücresi etkileşimi, diğerleri arasında. Geleneksel olarak, hücreler bağışıklık tehlikeye fareler içine ksenogreftli, ve bu alanda standart kalır. Ancak, bu model sistemi gibi çeşitli sınırlamalar vardır, yüksek maliyet gibi, düşük çoğaltma numaraları, doğru in vivo tümör yükünü niteleme zorluklar, ve tümörler için gereken uzun süre engraft ve ilaç testi tamamlanması için. Son yıllarda, zebra balığı alternatif bir ksenogreft modeli olarak ortaya çıkmıştır, ilk rapor ile 2005, yeşil floresan protein ile (GFP) etiketli insan melanom hücre hatları blastula-evre embriyolar içine nakledilen1,2. Daha yakın zamanda, 2 gün post-fertilizasyon (dpf) zebra balığı larvaları enjeksiyonanatomik yerinin kontrolü için ksenogreft alıcıları olarak ve çevredeki mikroçevre ile tümör etkileşiminin vivo görüntüleme yüksek çözünürlükte kullanılmak üzere kullanılmıştır3,4.
Zebra balığı ksenogreft modeli olarak birçok avantaj sunar. İlk olarak, yetişkin zebra balıkları nispeten düşük bir maliyetle büyük miktarlarda yetiştirilebilir ve ağırlanabilir. Yetişkin zebra balıklarının her çiftleşerek haftada yüzlerce larva balığı üretebilir. Küçük boyutları nedeniyle, bu larva zebra balıkları yüksek iş itme ilaç taraması için 96-iyi plakalar muhafaza edilebilir. Larvalar tipik bir ksenogreft deneyi sırasında beslenmek zorunda değildir, çünkü sarısı keseleri yaşamın ilk haftasında besinleri devam ettirir. Ayrıca, zebra balıkları 7 dpf’ye kadar tam işlevsel bir bağışıklık sistemine sahip değildir, yani ksenogreft enjeksiyonundan önce ışınlama veya immünsupresif rejimlere ihtiyaç duymaz. Son olarak, optik olarak berrak zebra balığı hatları tümör-mikroçevre etkileşimlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine olanak sağlar.
Belki de bir ksenogreft modeli olarak zebra balığının en umut verici uygulaması, insan kanser örnekleri üzerinde başka bir model organizma kullanılarak mümkün olmayan bir şekilde yüksek kapsamlı ilaç taraması yapabilme yeteneğidir. Larvalar deri yoluyla sudan ilaç absorbe, ilaç yönetimi kolaylığını artırmak5. Hayvanlar genellikle 100−300 μL suda 96 kuyulu tabaklarda muhafaza edildiklerinden, ekranlar farelere göre daha küçük ilaç miktarları gerektirir. Şu anda, zebra balığında ilaçların insan tümör yükü üzerindeki etkisinin standardizasyonu ve ölçülmesi için birkaç farklı yöntem vardır ve bunların bazıları yüksek iş yapma taraması için tek ilaç testinin ölçeklendirilmesi için diğerlerinden daha pratiktir. Örneğin, bazı gruplar tek hücreli süspansiyonlar halinde balık ayırmak ve süspansiyon bireysel damlacıkları görüntüleme ve yarı otomatik ImageJ makro4kullanarak floresan ölçerek floresan etiketli veya lekeli tümör hücreleri ölçmek 4 . Larva balıklarının 96 kuyulu plakalarda sabitlendiği ve kompozit görüntülerin yeniden düzenlenmesi nden ve tümör hücre foci6’nınsayısallaştırılmasından önce ters floresan mikroskop kullanılarak görüntülendiği yarı otomatik tam larva görüntüleme yöntemi geliştirilmiştir. Bu tahlillerin her ikisi de, zebrabalığı ksenogreft modellerinde gerçekten yüksek işlem li ilaç taraması pratik hale getiren nicelikselleştirme için oldukça emek yoğun yöntemlerdir.
Bu sorun Omurgalı Otomatik Tarama Teknolojisi (VAST) Biyoimager ve Büyük Parçacık (LP) Örnekleyici, bir floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesi(Şekil 1 ve Malzeme Tablosu)geliştirilmesi ile ele alınmıştır, zebrabalığı larvalarıyüksekişlem görüntüleme için gerçekten otomatik bir yöntemdir 7,8,9. Bu ünite ile balıklar anestezi altına alınır, otomatik olarak 96 kuyulu bir plakadan örneklenir, kılcal damara yerleştirilir ve önceden ayarlanmış bir kullanıcı tercihine göre set oryantasyonuna döndürülür, görüntülenir ve daha sonraki çalışmalar için 96 kuyulu yeni bir plakanın aynı kuyuya geri yerleştirilir veya atılır. Zebrabalığı ksenogreftleri ile bu görüntüleme teknolojisi nin birleştirilmesi, bireysel hasta tümörlerine karşı büyük ilaç bileşik kütüphanelerinin yüksek işlem li ilaç taraması kullanan kişiselleştirilmiş ilaç olasılığına olanak sağlayabilir. Zebra balığı ksenogreftler de vivo yeni bileşiklerin toksisitesi ve etkinliğini test etmek için büyük ölçekli ve düşük maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Zebra balığı fare ksenogreft modellerine geçmeden önce bir ön tarama adımı olarak kullanılabilir.
Birincil hasta lösemi hücrelerinin zebra balığına dönüştürülmesi ve diğer primer hasta tümör hücrelerine veya kanser hücresi hattına uygulanabilen otomatik görüntüleme ve niceleme ile yüksek iş yapma lı ilaç ekranları gerçekleştirmek için düzenli bir iş akışı geliştirdik. Bu iş akışı, mevcut standardizasyon ve niceleme yöntemlerini geliştirmek için floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesinden yararlanmış ve in vivo tümör kütlesini ölçmek için daha önceki, daha emek yoğun yöntemlere otomatik bir alternatif sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, primer hasta lösemi hücrelerinin ksenogreft modeli olarak zebra balığına doğru çözülmesi ve enjeksiyonu için standart laştırılmış bir yöntem gösterilmiştir. Ayrıca floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesi kullanılarak ksenogreftli zebra balıklarının yüksek iş itimatlı ilaç taraması için bir protokol oluşturduk. Daha önce insan hücre hatları ile ksenogreftler bildirilmiştir ve ksenogreftli tümörlerin yüksek iş lenme li b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma V Vakfı V Scholar Ödülü ve NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (J.S. Blackburn için) ve NIH Eğitim Hibe T32CA165990 (M.G. Haney için) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
