المعاوقة القائمة على قياس في الوقت الحقيقي من هجرة الخلايا السرطانية والغزو
Summary
السرطان هو مرض قاتل بسبب قدرته على الانبثاث إلى أعضاء مختلفة. تحديد قدرة الخلايا السرطانية على الهجرة والغزو في ظل ظروف علاجية مختلفة أمر بالغ الأهمية لتقييم الاستراتيجيات العلاجية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لتقييم القدرات النقيلية في الوقت الحقيقي لخط الخلايا السرطانية الورم الأرومي الدبقي.
Abstract
ينشأ السرطان بسبب الانتشار غير المنضبط للخلايا التي بدأتها عدم الاستقرار الوراثي, الطفرات, والعوامل البيئية وغيرها من عوامل الإجهاد. هذه التشوهات المكتسبة في شبكات الإشارات الجزيئية المعقدة والمتعددة الطبقات تحفز انتشار الخلايا الشاذة والبقاء على قيد الحياة ، وتدهور المصفوفة خارج الخلية ، والانبثاث إلى الأعضاء البعيدة. وتشير التقديرات إلى أن ما يقرب من 90 في المائة من الوفيات المرتبطة بالسرطان ناجمة عن الآثار المباشرة أو غير المباشرة للنشر النقيلي. لذلك ، من المهم إنشاء نظام شامل وموثوق به للغاية لتوصيف سلوكيات الخلايا السرطانية على التلاعب الجيني والبيئي. مثل هذا النظام يمكن أن يعطي فهما واضحا للتنظيم الجزيئي للانبثاث السرطان وفرصة لتطوير ناجحة للاستراتيجيات العلاجية الطبقية والدقيقة. وبالتالي ، فإن التحديد الدقيق لسلوكيات الخلايا السرطانية مثل الهجرة والغزو مع كسب أو فقدان وظيفة الجينات (الجينات) يسمح بتقييم الطبيعة العدوانية للخلايا السرطانية. نظام القياس في الوقت الحقيقي على أساس مقاومة الخلايا تمكن الباحثين من الحصول على البيانات باستمرار خلال تجربة كاملة ومقارنة النتائج وقياسها على الفور في ظل ظروف تجريبية مختلفة. على عكس الطرق التقليدية، لا تتطلب هذه الطريقة التثبيت وتلطيخ ومعالجة العينة لتحليل الخلايا التي تهاجر أو تغزو. هذه الورقة الأسلوب يؤكد الإجراءات التفصيلية لتحديد في الوقت الحقيقي للهجرة وغزو الخلايا السرطانية الورم الأرومي الدبقي.
Introduction
السرطان هو مرض قاتل بسبب قدرته على الانبثاث إلى أعضاء مختلفة. تحديد الأنماط الجينية للسرطان والأنماط الظاهرية أمر بالغ الأهمية لفهم وتصميم استراتيجيات علاجية فعالة. وقد أدت عقود من أبحاث السرطان إلى تطوير وتكييف أساليب مختلفة لتحديد الأنماط الجينية للسرطان والأنماط الظاهرية. واحدة من أحدث التطورات التقنية هو قياس في الوقت الحقيقي من هجرة الخلايا والغزو على أساس مقاومة الخلايا. الالتصاق الخلية إلى ركائز وخلية الخلية الاتصالات تلعب دورا هاما في الاتصالات خلية إلى خلية، وتطوير، وصيانة الأنسجة. تؤدي التشوهات في التصاق الخلايا إلى فقدان ملامسة الخلية ، وتدهور المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، واكتساب قدرات الهجرة والغزو من قبل الخلايا ، وكلها تساهم في انتشار الخلايا السرطانية إلى أجهزة مختلفة1،2. تتوفر طرق مختلفة لتحديد هجرة الخلايا (تئام الجروح ومقالات غرفة بويدن) والغزو (ماتريغل- بويدن الحجرة)3,4,5. هذه الطرق التقليدية شبه كمية لأن الخلايا تحتاج إلى أن تكون وصفت بصبغة الفلورسنت أو الأصباغ الأخرى إما قبل أو بعد التجربة لقياس الأنماط الظاهرية للخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى اضطرابات ميكانيكية في بعض الحالات لخلق جرح لقياس هجرة الخلايا إلى موقع الجرح. فضلاً عن ذلك فإن هذه الأساليب القائمة تستغرق وقتاً طويلاً، وكثيفة العمالة، وتقيس النتائج في وقت واحد فقط. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الأساليب عرضة لإجراء قياسات غير دقيقة بسبب التعامل غير المتسق أثناء الإجراء التجريبي6.
على عكس الطرق التقليدية، يقيس نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي مقاومة الخلايا في الوقت الحقيقي دون الحاجة إلى تلف الخلايا قبل أو ما بعد تلطيخ هاوية. والأهم من ذلك، يمكن تمديد مدة التجربة بحيث يمكن تحديد الآثار البيولوجية بطريقة تعتمد على الوقت. تنفيذ التجربة هو الوقت الفعال وليس كثيف العمالة. تحليل البيانات بسيط نسبيا ودقيق. بالمقارنة مع أساليب أخرى، وهذا الأسلوب هو واحد من أفضل القياسات في الوقت الحقيقي لقياس هجرة الخلايا والغزو6،7،8،9.9
كان جيافير وكيس أول من وصف القياس القائم على المعاوقة لخلايا السكان على سطح الأقطاب الكهربائية10. يعمل نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي على نفس المبدأ. مساحة كل بئر microplate هو ما يقرب من 80٪ مغطاة بمجموعة من الأقطاب الدقيقة الذهب. عندما تكون منطقة سطح القطب تشغلها الخلايا بسبب الالتزام أو انتشار الخلايا ، يتغير المعاوقة الكهربائية. يتم عرض هذا المعاوقة كمؤشر الخلية ، والذي يتناسب مباشرة مع الخلايا التي تغطي مساحة سطح القطب بعد أن تخترق الغشاء المسامي (متوسط حجم المسام لهذا الغشاء هو 8 ميكرومتر)11.
Crk وCrkL هي بروتينات محول تحتوي على مجالات SH2 و SH3 وتلعب أدوارًا مهمة في وظائف خلوية مختلفة ، مثل تنظيم الهيكل الخلوي ، وتحويل الخلايا ، والانتشار ، والالتصاق ، والظهارية – mesenchymal الانتقال ، والهجرة ، والغزو ، والانبثاث عن طريق التوسط بين البروتين البروتين والبروتين التفاعلات في العديد من مسارات الإشارات1،12،13،14،15،16،17، 18. لذلك ، من المهم تحديد قدرات الهجرة والغازية التي تعتمد على Crk / CrkL للخلايا السرطانية. تم إجراء تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي لتحديد القدرات المهاجرة والغازية لخلايا الورم الأرومي عند الضربة القاضية الجينية لـ Crk و CrkL.
تصف ورقة الأسلوب هذه قياسات تفصيلية للهجرة وغزو خلايا الورم الأرومي البشري بوساطة كرك وCrkL.
Protocol
Representative Results
Discussion
القياس في الوقت الحقيقي من هجرة الخلايا والغزو باستخدام نظام تحليل الخلية في الوقت الحقيقي هو عملية مراقبة بسيطة وسريعة ومستمرة مع مزايا متعددة وهامة على الأساليب التقليدية التي توفر البيانات في نقطة زمنية واحدة. كما هو الحال مع الأساليب التقليدية ، يجب تحسين الشروط التجريبية لكل خط خلي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أوليفيا فونك على مساعدتها التقنية في بيانات نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي. كما نشكر مركز الكتابة الطبية في مدينة ميرسي كانساس سيتي للأطفال على تحرير هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل توم كيفيني الموهوب صندوق لأبحاث سرطان الأطفال (إلى TP) ومستشفى الأطفال الرحمة الغرب الأوسط السرطان تحالف شريك المجلس الاستشاري (إلى TP).
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O’Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
