Le cancer est une maladie mortelle en raison de sa capacité à métastaser à différents organes. Déterminer la capacité des cellules cancéreuses à migrer et à envahir dans diverses conditions de traitement est crucial pour évaluer les stratégies thérapeutiques. Ce protocole présente une méthode pour évaluer les capacités métastatiques en temps réel d’une lignée de cellules cancéreuses de glioblastome.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules cancéreuses
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cancer survient en raison de la prolifération incontrôlée des cellules initiées par l’instabilité génétique, les mutations, et l’environnement et d’autres facteurs de stress. Ces anomalies acquises dans les réseaux de signalisation moléculaire complexes et multicouches induisent la prolifération et la survie aberrantes de cellules, la dégradation extracellulaire de matrice, et la métastase aux organes éloignés. On estime qu’environ 90 % des décès liés au cancer sont causés par les effets directs ou indirects de la dissémination métastatique. Par conséquent, il est important d’établir un système très fiable et complet pour caractériser les comportements des cellules cancéreuses sur les manipulations génétiques et environnementales. Un tel système peut donner une compréhension claire de la régulation moléculaire des métastases cancéreuses et la possibilité de développer avec succès des stratégies thérapeutiques stratifiées et précises. Par conséquent, une détermination précise des comportements des cellules cancéreuses telles que la migration et l’invasion avec gain ou perte de fonction du gène(s) permet d’évaluer la nature agressive des cellules cancéreuses. Le système de mesure en temps réel basé sur l’impédance cellulaire permet aux chercheurs d’acquérir continuellement des données au cours d’une expérience entière et de comparer et de quantifier instantanément les résultats dans diverses conditions expérimentales. Contrairement aux méthodes conventionnelles, cette méthode ne nécessite pas de fixation, de coloration et de traitement d’échantillon pour analyser les cellules qui migrent ou envahissent. Ce document de méthode met l’accent sur les procédures détaillées pour la détermination en temps réel de la migration et l’invasion des cellules cancéreuses de glioblastome.
Introduction
Le cancer est une maladie mortelle en raison de sa capacité à métastaser à différents organes. La détermination des génotypes et des phénotypes du cancer est essentielle à la compréhension et à la conception de stratégies thérapeutiques efficaces. Des décennies de recherche sur le cancer ont mené au développement et à l’adaptation de différentes méthodes pour déterminer les génotypes et les phénotypes du cancer. L’un des derniers développements techniques est la mesure en temps réel de la migration cellulaire et l’invasion basée sur l’impédance cellulaire. L’adhérence cellulaire aux substrats et aux contacts cellulaires joue un rôle important dans la communication et ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
REMARQUE: Tous les matériaux de culture cellulaire doivent être stériles et toute l’expérience doit être effectuée dans une armoire de biosécurité dans des conditions stériles.
1. Culture et électroporation de la lignée cellulaire U-118MG Glioblastoma
- Culture la lignée cellulaire U-118MG dans le sérum bovin fœtal (FBS) à 5 % contenant le medium d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco (milieu culturel) et maintenue à 37 oC dans une atmosphère humide contenant 5 % de CO2 incubateur (conditions culturelles).
- Utilisez des cellules saines confluentes de 70 à 80 % pour l’électroporation.
- Pour l....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Il a été suggéré que Crk et CrkL sont importants pour la migration cellulaire et l’invasion dans différentes lignées de cellules cancéreuses13,17. Bien que les protéines Crk et CrkL soient structurellement et fonctionnellement semblables les unes aux autres et jouent les fonctions de chevauchement essentielles16,19,20,21, beaucoup d’étu.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La mesure en temps réel de la migration cellulaire et de l’invasion à l’aide du système d’analyse cellulaire en temps réel est un processus de surveillance simple, rapide et continu avec des avantages multiples et significatifs par rapport aux méthodes traditionnelles qui fournissent des données à un moment donné. Comme pour les méthodes traditionnelles, les conditions expérimentales doivent être optimisées pour chaque lignée cellulaire pour le système d’analyse cellulaire en temps réel, car chaque lignée cellulaire peut.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions Olivia Funk pour son assistance technique aux données du système d’analyse cellulaire en temps réel. Nous remercions également le Medical Writing Center de Children’s Mercy Kansas City d’avoir édité ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (à TP) et par children’s Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Council funding (to TP).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Armoire de biosécurité | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Classe II, Type A2 | |
| Plaques CIM | Division d’analyse cellulaire d’Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Plaques d’invasion et de migration cellulaires |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID : 3522 et ID : 3524 | |
| Dulbecco' s aigle modifié' milieu (DMEM) | ATCC | 302002 | Milieu de culture utilisé pour la culture cellulaire |
| Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS utilisé pour laver les cellules |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubateur | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 incubateur |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Gel matriciel extracellulaire |
| Système d’électroporation au néon | ThermoFisher Scientific | Système d’électroporation | |
| Système de transfection au néon 10 µ ; L kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Kit d’électroporation |
| SiRNA non ciblé | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA pour contrôle non targated |
| Odyssey CLx (système d’imagerie) | LI-COR Biosciences | Système d’imagerie Western blot | |
| Logiciel RTCA | Division d’analyse cellulaire d’Agilent Technologies, Inc | Instrument utilisé pour l’expérience | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Compteur de cellules automatisé portable |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC ATCC HTB15 | Lignées cellulaires utilisées pour les expériences | |
| xCELLigence RTCA DP | Division d’analyse cellulaire d’Agilent Technologies, Inc | Instrument utilisé pour l’expérience |
Références
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
Explorer plus d’articles
