Misurazione in tempo reale dell'invasione e dell'invasione delle cellule tumorali basata sull'impedimento
Summary
Il cancro è una malattia letale a causa della sua capacità di metastasi a diversi organi. Determinare la capacità delle cellule tumorali di migrare e invadere in varie condizioni di trattamento è fondamentale per valutare le strategie terapeutiche. Questo protocollo presenta un metodo per valutare le capacità metastatiche in tempo reale di una linea cellulare del cancro del glioblastoma.
Abstract
Il cancro nasce a causa della proliferazione incontrollata delle cellule iniziata dall’instabilità genetica, mutazioni e fattori ambientali e di altro tipo. Queste hanno acquisito anomalie in complesse reti di segnalazione molecolare a più livelli che inducono la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule aberranti, la degradazione della matrice extracellulare e la metastasi a organi distanti. Si stima che circa il 90% dei decessi correlati al cancro sia causato dagli effetti diretti o indiretti della diffusione metastatica. Pertanto, è importante stabilire un sistema altamente affidabile e completo per caratterizzare i comportamenti delle cellule tumorali sulle manipolazioni genetiche e ambientali. Tale sistema può dare una chiara comprensione della regolazione molecolare della metastasi del cancro e l’opportunità di sviluppare con successo strategie terapeutiche stratificate e precise. Pertanto, una determinazione accurata dei comportamenti delle cellule tumorali come la migrazione e l’invasione con guadagno o perdita di funzione dei geni consente di valutare la natura aggressiva delle cellule tumorali. Il sistema di misurazione in tempo reale basato sull’impedimento cellulare consente ai ricercatori di acquisire continuamente dati durante un intero esperimento e di confrontare e quantificare istantaneamente i risultati in varie condizioni sperimentali. A differenza dei metodi convenzionali, questo metodo non richiede fissazione, colorazione ed elaborazione del campione per analizzare le celle che migrano o invadono. Questo documento sul metodo enfatizza le procedure dettagliate per la determinazione in tempo reale della migrazione e dell’invasione delle cellule tumorali del glioblastoma.
Introduction
Il cancro è una malattia letale a causa della sua capacità di metastasi a diversi organi. Determinare i genotipi e i fenotipi del cancro è fondamentale per comprendere e progettare strategie terapeutiche efficaci. Decenni di ricerca sul cancro hanno portato allo sviluppo e all’adattamento di diversi metodi per determinare i genotipi e i fenotipi del cancro. Uno degli ultimi sviluppi tecnici è la misurazione in tempo reale della migrazione cellulare e dell’invasione basata sull’impedimento cellulare. L’adesione cellulare ai substrati e ai contatti cellulare svolge un ruolo importante nella comunicazione e nella regolazione cellulare-cellulare, nello sviluppo e nella manutenzione dei tessuti. Le anomalie nell’adesione cellulare portano alla perdita del contatto cellulare, alla degradazione della matrice extracellulare (ECM), e al guadagno di capacità migratorie e invasive da parte delle cellule, che contribuiscono alla metastasi delle cellule tumorali a diversi organi1,2. Sono disponibili vari metodi per determinare la migrazione cellulare (guarigione delle ferite e saggi della camera di Boyden) e l’invasione (saggio della camera Matrigel-Boyden)3,4,5.5 Questi metodi convenzionali sono semiquantitativi perché le cellule devono essere etichettate con un colorante fluorescente o altri coloranti prima o dopo l’esperimento per misurare i fenotipi cellulari. Inoltre, sono necessari disturbi meccanici in alcuni casi per la creazione di una ferita per misurare la migrazione delle cellule al sito della ferita. Inoltre, questi metodi esistenti richiedono molto tempo, richiedono molto lavoro e misurano i risultati in un solo momento. Inoltre, questi metodi sono inclini a effettuare misurazioni imprecise a causa di una manipolazione incoerente durante la procedura sperimentale6.
A differenza dei metodi convenzionali, il sistema di analisi cellulare in tempo reale misura l’impedimento cellulare in tempo reale senza richiedere danni pre o post-staining e meccanici delle cellule. Ancora più importante, la durata di un esperimento può essere estesa in modo che gli effetti biologici possano essere determinati in modo dipendente dal tempo. L’esecuzione dell’esperimento è efficiente in termini di tempo e non richiede molto lavoro. L’analisi dei dati è relativamente semplice e accurata. Rispetto ad altri metodi, questo metodo è una delle migliori misurazioni in tempo reale per misurare la migrazione cellulare e l’invasione6,7,8,9.
Giaever e Keese sono stati i primi a descrivere la misurazione basata sull’impedanza di una popolazione cellulare sulla superficie degli elettrodi10. Il sistema di analisi cellulare in tempo reale funziona sullo stesso principio. L’area di ogni pozzo di micropiastra è circa l’80% coperto da una serie di microelettrodi d’oro. Quando la superficie dell’elettrodo è occupata dalle cellule a causa dell’aderenza o della diffusione delle cellule, l’impedimento elettrico cambia. Questo impedimento viene visualizzato come indice cellulare, che è direttamente proporzionale alle cellule che coprono la superficie dell’elettrodo dopo che penetrano la membrana microporosa (la dimensione mediana dei pori di questa membrana è di 8 m)11.
Crk e CrkL sono proteine adattatori e contenenti domini SH2 e SH3 e svolgono ruoli importanti in varie funzioni cellulari, come la regolazione del citoscheletro, la trasformazione cellulare, la proliferazione, l’adesione, la transizione epiteliale-mesenchy, la migrazione, l’invasione e la metastasi mediando le interazioni proteina-proteina in molte vie di segnalazione1,12,13,14,15,16,1717. 18. Pertanto, è importante determinare le capacità migratorie e invasive dipendenti da Crk/CrkL delle cellule tumorali. L’analisi cellulare in tempo reale è stata eseguita per determinare le capacità migratorie e invasive delle cellule glioblastoma al knockdown genico di Crk e CrkL.
Questo documento di metodo descrive misurazioni dettagliate della migrazione mediata da Crk- e CrkL e l’invasione delle cellule glioblastoma umane.
Protocol
Representative Results
Discussion
La misurazione in tempo reale della migrazione e dell’invasione cellulare utilizzando il sistema di analisi cellulare in tempo reale è un processo di monitoraggio semplice, rapido e continuo con molteplici e significativi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali che forniscono dati in un singolo momento. Come per i metodi tradizionali, le condizioni sperimentali devono essere ottimizzate per ogni linea cellulare per il sistema di analisi cellulare in tempo reale, perché ogni linea cellulare può essere diversa in termi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Olivia Funk per la sua assistenza tecnica con i dati del sistema di analisi cellulare in tempo reale. Ringraziamo anche il Medical Writing Center di Children’s Mercy Kansas City per aver curato questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (to TP) e dal finanziamento del Children’s Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board (a TP).
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
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