Impedansbasert sanntidsmåling av kreftcellemigrasjon og invasjon
Summary
Kreft er en dødelig sykdom på grunn av sin evne til å metastasere til forskjellige organer. Å bestemme kreftcellenes evne til å migrere og invadere under ulike behandlingsforhold er avgjørende for å vurdere terapeutiske strategier. Denne protokollen presenterer en metode for å vurdere sanntids metastatiske evner av en glioblastom kreft cellelinje.
Abstract
Kreft oppstår på grunn av ukontrollert spredning av celler initiert av genetisk ustabilitet, mutasjoner og miljømessige og andre stressfaktorer. Disse ervervede abnormiteter i komplekse, flerlags molekylære signalnettverk indusereavvikende cellespredning og overlevelse, ekstracellulær matrisenedbrytning og metastase til fjerne organer. Omtrent 90 % av kreftrelaterte dødsfall anslås å være forårsaket av direkte eller indirekte effekter av metastatisk formidling. Derfor er det viktig å etablere et svært pålitelig, omfattende system for å karakterisere kreftcelleatferd på genetiske og miljømessige manipulasjoner. Et slikt system kan gi en klar forståelse av molekylær regulering av kreftmetastase og muligheten for vellykket utvikling av stratifiserte, presise terapeutiske strategier. Derfor tillater nøyaktig bestemmelse av kreftcelleatferd som migrasjon og invasjon med gevinst eller tap av funksjon av gen(er) vurdering av kreftcellenes aggressive natur. Sanntidsmålingssystemet basert på celleimpedans gjør det mulig for forskere å kontinuerlig skaffe data under et helt eksperiment og umiddelbart sammenligne og kvantifisere resultatene under ulike eksperimentelle forhold. I motsetning til konvensjonelle metoder krever denne metoden ikke fiksering, farging og prøvebehandling for å analysere celler som migrerer eller invaderer. Denne metoden papir understreker detaljerte prosedyrer for sanntid bestemmelse av migrasjon og invasjon av glioblastom kreftceller.
Introduction
Kreft er en dødelig sykdom på grunn av sin evne til å metastasere til forskjellige organer. Å bestemme kreftgenotyper og fenotyper er avgjørende for å forstå og utforme effektive terapeutiske strategier. Tiår med kreftforskning har ført til utvikling og tilpasning av ulike metoder for å bestemme kreftgenotyper og fenotyper. En av de nyeste tekniske utviklingene er sanntidsmåling av cellemigrasjon og invasjon basert på celleimpedans. Cellevedheft til underlag og cellecellekontakter spiller en viktig rolle i celle-til-celle-kommunikasjon og -regulering, utvikling og vedlikehold av vev. Abnormiteter i cellevedhesjon fører til tap av cellecellekontakt, nedbrytning av ekstracellulær matrise (ECM), og gevinst av trekk- og invaderende egenskaper av celler, som alle bidrar til metastase av kreftceller til forskjellige organer1,2. Ulike metoder er tilgjengelige for å bestemme cellemigrasjon (sårheling og Boyden kammeranalyser) og invasjon (Matrigel-Boyden kammeranalyse)3,4,5. Disse konvensjonelle metodene er semikvantitative fordi celler må merkes med en fluorescerende fargestoff eller andre fargestoffer enten før eller etter eksperimentet for å måle celle fenotyper. I tillegg er det nødvendig med mekaniske forstyrrelser i noen tilfeller for å skape et sår for å måle migrering av celler til sårstedet. Videre er disse eksisterende metodene tidkrevende, arbeidskrevende, og måler resultatene på bare ett tidspunkt. I tillegg er disse metodene utsatt for å gjøre unøyaktige målinger på grunn av inkonsekvent håndtering under eksperimentell prosedyre6.
I motsetning til konvensjonelle metoder måler sanntidscelleanalysesystemet celleimpedans i sanntid uten å kreve pre- eller poststaining og mekanisk skade av celler. Enda viktigere, varigheten av et eksperiment kan forlenges slik at biologiske effekter kan bestemmes på en tidsavhengig måte. Å utføre eksperimentet er tidseffektivt og ikke arbeidskrevende. Analyse av data er relativt enkelt og nøyaktig. Sammenlignet med andre metoder, er denne metoden en av de beste sanntidsmålingene for å måle cellemigrasjon og invasjon6,7,8,9.
Giaever og Keese var de første som beskrev den impedansbaserte målingen av en cellepopulasjon på overflaten av elektroder10. Sanntidscelleanalysesystemet fungerer på samme prinsipp. Området for hver mikroplatebrønn er ca. 80 % dekket med en rekke gullmikroelektroder. Når elektrodenoverflaten er okkupert av celler på grunn av overholdelse eller spredning av cellene, endres den elektriske impedansen. Denne impedansen vises som celleindeksen, som er direkte proporsjonal med cellene som dekker elektrodens overflateområde etter at de trenger inn i mikroporøsmembranen (median porestørrelse på denne membranen er 8 μm)11.
Crk og CrkL er adapterproteiner som inneholder SH2- og SH3-domener og spiller viktige roller i ulike cellulære funksjoner, for eksempel cytoskjelettregulering, celletransformasjon, spredning, adhesjon, epitel-mesenchymal overgang, migrasjon, invasjon og metastase ved å formidle proteinproteininteraksjoner i mange signalveier1,,12,,13,,14,,15,16,17, 18. Derfor er det viktig å bestemme Crk / CrkL-avhengige trekk- og invasive evner av kreftceller. Sanntidscelleanalyse ble utført for å bestemme de migrerende og invasive evnene til glioblastomceller ved genknockdown av Crk og CrkL.
Denne metoden papir beskriver detaljerte målinger av Crk- og CrkL-mediert migrasjon og invasjon av menneskelige glioblastomceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sanntidsmåling av celleoverføring og invasjon ved hjelp av sanntidscelleanalysesystemet er en enkel, rask og kontinuerlig overvåkingsprosess med flere, betydelige fordeler over de tradisjonelle metodene som gir data på et enkelt tidspunkt. Som med de tradisjonelle metodene, må eksperimentelle forhold optimaliseres for hver cellelinje for sanntidscelleanalysesystemet, fordi hver cellelinje kan være forskjellig når det gjelder adhesjon til substratet, veksten, celle-til-celle-kontaktene og trekk- og invasive evner. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Olivia Funk for hennes tekniske assistanse med sanntidscelleanalysesystemdata. Vi takker også Medical Writing Center på Children’s Mercy Kansas City for redigering av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (til TP) og av Children’s Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board funding (til TP).
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O’Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
