Medición en tiempo real basada en impedancia de la migración e invasión de células cancerosas
Summary
El cáncer es una enfermedad letal debido a su capacidad para hacer metástasis en diferentes órganos. Determinar la capacidad de las células cancerosas para migrar e invadir bajo diversas condiciones de tratamiento es crucial para evaluar las estrategias terapéuticas. Este protocolo presenta un método para evaluar las capacidades metastásicas en tiempo real de una línea celular de cáncer de glioblastoma.
Abstract
El cáncer surge debido a la proliferación incontrolada de células iniciada por inestabilidad genética, mutaciones y factores ambientales y de estrés. Estas anomalías adquiridas en complejas redes de señalización molecular multicapa inducen la proliferación y supervivencia celular aberrante, la degradación de la matriz extracelular y la metástasis a órganos distantes. Se estima que aproximadamente el 90% de las muertes relacionadas con el cáncer son causadas por los efectos directos o indirectos de la diseminación metastásica. Por lo tanto, es importante establecer un sistema integral y altamente confiable para caracterizar los comportamientos de las células cancerosas en las manipulaciones genéticas y ambientales. Tal sistema puede dar una comprensión clara de la regulación molecular de la metástasis del cáncer y la oportunidad de desarrollo exitoso de estrategias terapéuticas estratificadas y precisas. Por lo tanto, la determinación precisa de los comportamientos de las células cancerosas, como la migración y la invasión con ganancia o pérdida de la función de los genes, permite evaluar la naturaleza agresiva de las células cancerosas. El sistema de medición en tiempo real basado en la impedancia celular permite a los investigadores adquirir continuamente datos durante todo un experimento y comparar y cuantificar instantáneamente los resultados en diversas condiciones experimentales. A diferencia de los métodos convencionales, este método no requiere fijación, tinción y procesamiento de muestras para analizar las celdas que migran o invaden. Este documento de método hace hincapié en procedimientos detallados para la determinación en tiempo real de la migración y la invasión de células cancerosas de glioblastoma.
Introduction
El cáncer es una enfermedad letal debido a su capacidad para hacer metástasis en diferentes órganos. Determinar los genotipos y fenotipos del cáncer es fundamental para comprender y diseñar estrategias terapéuticas eficaces. Décadas de investigación del cáncer han llevado al desarrollo y adaptación de diferentes métodos para determinar los genotipos y fenotipos del cáncer. Uno de los últimos avances técnicos es la medición en tiempo real de la migración e invasión celular basada en la impedancia celular. La adhesión celular a sustratos y contactos celulares juegan un papel importante en la comunicación y regulación de células a células, el desarrollo y el mantenimiento de los tejidos. Las anomalías en la adhesión celular conducen a la pérdida del contacto celular, la degradación de la matriz extracelular (ECM), y la ganancia de capacidades migratorias e invasoras por las células, todas las cuales contribuyen a la metástasis de las células cancerosas a diferentes órganos1,,2. Hay varios métodos disponibles para determinar la migración celular (curación de heridas y ensayos de cámara Boyden) y la invasión (ensayo de cámara Matrigel-Boyden)3,4,5. Estos métodos convencionales son semicuantitativos porque las células necesitan ser etiquetadas con un tinte fluorescente u otros tintes antes o después del experimento para medir los fenotipos celulares. Además, se necesitan interrupciones mecánicas en algunos casos para crear una herida para medir la migración de células al sitio de la herida. Además, estos métodos existentes consumen mucho tiempo, requieren mucha mano de obra y miden los resultados en un solo momento. Además, estos métodos son propensos a realizar mediciones inexactas debido a un manejo inconsistente durante el procedimiento experimental6.
A diferencia de los métodos convencionales, el sistema de análisis celular en tiempo real mide la impedancia celular en tiempo real sin necesidad de daño mecánico o previo o postmanchado de las células. Más importante aún, la duración de un experimento puede ampliarse para que los efectos biológicos puedan determinarse de una manera dependiente del tiempo. La ejecución del experimento es eficiente en el tiempo y no requiere mucha mano de obra. El análisis de datos es relativamente simple y preciso. En comparación con otros métodos, este método es una de las mejores mediciones en tiempo real para medir la migración celular y la invasión6,7,8,9.
Giaever y Keese fueron los primeros en describir la medición basada en impedancia de una población celular en la superficie de los electrodos10. El sistema de análisis celular en tiempo real funciona en el mismo principio. El área de cada pozo de microplaca está aproximadamente 80% cubierta con una serie de microelectrodos de oro. Cuando el área de superficie del electrodo está ocupada por células debido a la adherencia o propagación de las células, la impedancia eléctrica cambia. Esta impedancia se muestra como el índice celular, que es directamente proporcional a las células que cubren el área de la superficie del electrodo después de que penetren en la membrana microporosa (el tamaño del poro mediano de esta membrana es de 8 m)11.
Crk y CrkL son proteínas adaptadoras que contienen dominios SH2 y SH3 y desempeñan un papel importante en diversas funciones celulares, como la regulación del citoesqueleto, la transformación celular, la proliferación, la adhesión, la transición epitelial-mesenquimal, la migración, la invasión y la metástasis mediante la mediación de interacciones proteína-proteína en muchas vías de señalización1,12,13,14,15,16,17, 18. Por lo tanto, es importante determinar las capacidades migratorias e invasivas dependientes de Crk/CrkL de las células cancerosas. Se realizó un análisis celular en tiempo real para determinar las capacidades migratorias e invasivas de las células de glioblastoma tras la desconexión genética de Crk y CrkL.
Este documento de método describe mediciones detalladas de la migración mediada por Crk- y CrkL y la invasión de células de glioblastoma humano.
Protocol
Representative Results
Discussion
La medición en tiempo real de la migración e invasión celular utilizando el sistema de análisis celular en tiempo real es un proceso de monitoreo simple, rápido y continuo con múltiples ventajas significativas sobre los métodos tradicionales que proporcionan datos en un solo punto de tiempo. Al igual que con los métodos tradicionales, las condiciones experimentales deben optimizarse para cada línea celular para el sistema de análisis celular en tiempo real, ya que cada línea celular puede ser diferente en tér…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Olivia Funk por su asistencia técnica con los datos del sistema de análisis celular en tiempo real. También agradecemos al Centro de Escritura Médica de Children’s Mercy Kansas City por editar este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (to TP) y por Children’s Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Partner Board funding (to TP).
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
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