Empedans tabanlı Gerçek Zamanlı Kanser Hücre Göçü ve İstilası Ölçümü
Summary
Kanser, farklı organlara metastaz yeteneği nedeniyle ölümcül bir hastalıktır. Kanser hücrelerinin çeşitli tedavi koşulları altında göç ve işgal yeteneğini belirlemek terapötik stratejilerin değerlendirilmesi için çok önemlidir. Bu protokol glioblastoma kanser hücre hattının gerçek zamanlı metastatik yeteneklerini değerlendirmek için bir yöntem sunar.
Abstract
Kanser genetik istikrarsızlık, mutasyonlar ve çevresel ve diğer stres faktörleri tarafından başlatılan hücrelerin kontrolsüz çoğalması nedeniyle ortaya çıkar. Karmaşık, çok katmanlı moleküler sinyal ağlarında elde edilen bu anormallikler anormal hücre çoğalması ve sağkalım, hücre dışı matriks bozulması ve uzak organlara metastaz neden olur. Kansere bağlı ölümlerin yaklaşık %90’ının metastatik yayılmanın doğrudan veya dolaylı etkilerinden kaynaklandığı tahmin edilmektedir. Bu nedenle, genetik ve çevresel manipülasyonlar üzerine kanser hücresi davranışlarını karakterize etmek için son derece güvenilir, kapsamlı bir sistem kurmak önemlidir. Böyle bir sistem kanser metastazımoleküler düzenleme ve tabakalı, hassas tedavi stratejilerinin başarılı gelişimi için fırsat net bir anlayış verebilir. Bu nedenle, gen (ler) kazanç veya fonksiyon kaybı ile göç ve invazyon gibi kanser hücresi davranışlarının doğru belirlenmesi kanser hücrelerinin agresif doğasının değerlendirilmesini sağlar. Hücre empedansına dayalı gerçek zamanlı ölçüm sistemi, araştırmacıların tüm deney sırasında sürekli olarak veri edinmelerine ve çeşitli deneysel koşullar altında sonuçları anında karşılaştırmalarına ve ölçmelerine olanak tanır. Geleneksel yöntemlerin aksine, bu yöntem göç eden veya istila eden hücreleri analiz etmek için fiksasyon, boyama ve numune işleme gerektirmez. Bu yöntem kağıt göç ve glioblastoma kanser hücrelerinin invazyonu gerçek zamanlı belirlenmesi için ayrıntılı prosedürleri vurgulamaktadır.
Introduction
Kanser, farklı organlara metastaz yeteneği nedeniyle ölümcül bir hastalıktır. Kanser genotipleri ve fenotiplerinin belirlenmesi, etkili tedavi stratejilerinin anlaşılması ve tasarlanması açısından önemlidir. Onlarca yıllık kanser araştırmaları, kanser genotipleri ve fenotiplerini belirlemek için farklı yöntemlerin geliştirilmesine ve uyarlanındı. En son teknik gelişmelerden biri hücre empedansı dayalı hücre göçü ve invazyonu gerçek zamanlı ölçüm. Hücre adezyonu substratlar ve hücre-hücre temasları hücre-hücre iletişimi ve düzenlenmesi, geliştirilmesi ve dokuların bakımında önemli bir rol oynar. Hücre adezyonu anormallikleri hücre-hücre teması nın kaybına yol açar, hücre dışı matriks bozulması (ECM), ve hücreler tarafından göç ve işgal yetenekleri kazanç, hepsi farklı organlara kanser hücrelerinin metastazıkatkıda1,2. Çeşitli yöntemler hücre göçü belirlemek için kullanılabilir (yara iyileşmesi ve Boyden odası tahlilleri) ve invazyon (Matrigel-Boyden oda tahlil)3,4,5. Hücre fenotiplerini ölçmek için deneyden önce veya sonra hücrelerin floresan boya veya diğer boyalarla etiketlenmeleri gerektiğinden, bu geleneksel yöntemler yarı kantitatiftir. Buna ek olarak, bazı durumlarda hücrelerin yara bölgesine geçişini ölçmek için bir yara oluşturmak için mekanik bozulmalara ihtiyaç vardır. Ayrıca, bu mevcut yöntemler zaman alıcı, emek yoğun ve sadece bir zaman noktada sonuçları ölçmek. Buna ek olarak, bu yöntemler deneysel prosedür6sırasında tutarsız işleme nedeniyle yanlış ölçümler yapmaya eğilimlidir.
Geleneksel yöntemlerin aksine, gerçek zamanlı hücre analiz sistemi hücrelerin ön veya poststaining ve mekanik hasar gerektirmeden gerçek zamanlı hücre empedansını ölçer. Daha da önemlisi, biyolojik etkilerin zamana bağlı bir şekilde belirlenebilmeleri için bir deneyin süresi uzatılabilir. Denemenin yürütülmesi zaman etkindir ve emek yoğun değildir. Verileri analiz etmek nispeten basit ve doğrudur. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem hücre göç ve invazyonuölçmekiçin en iyi gerçek zamanlı ölçümler biridir 6,7,8,9.
Giaever ve Keese elektrotlar yüzeyinde bir hücre popülasyonunun empedans tabanlı ölçüm tanımlamak için ilk10. Gerçek zamanlı hücre analiz sistemi aynı prensipte çalışır. Her mikroplaka kuyunun alanı yaklaşık % 80 altın mikroelektrotlar bir dizi ile kaplıdır. Elektrot yüzey alanı, hücrelerin yapışması veya yayılması nedeniyle hücreler tarafından işgal edildiğinde, elektriksel empedans değişir. Bu empedans, mikro gözenekli membrana girdikten sonra elektrot yüzey alanını kaplayan hücrelerle doğru orantılı olan hücre indeksi olarak görüntülenir (bu zarın ortanca gözenek boyutu 8 μm’dir)11.
Crk ve CrkL, SH2 ve SH3 etki alanlarını içeren adaptör proteinlerdir ve sitoiskelet düzenlemesi, hücre dönüşümü, çoğalma, yapışma, epitel-mezenkimal geçiş, göç, invazyon ve metastaz gibi çeşitli hücresel fonksiyonlarda önemli rol oynayan birçok sinyal yolu 1,12,13,14,15,16,17,17 18 yaşında. Bu nedenle, kanser hücrelerinin Crk/CrkL’ye bağımlı göçmen ve invaziv yeteneklerini belirlemek önemlidir. Crk ve CrkL’nin gen nakavtı üzerine glioblastoma hücrelerinin göçmen ve invaziv yeteneklerini belirlemek için gerçek zamanlı hücre analizi yapıldı.
Bu yöntem ödevinde Crk ve CrkL aracılı göç ve insan glioblastom hücrelerinin invazyonunun ayrıntılı ölçümleri açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gerçek zamanlı hücre analiz sistemi kullanılarak hücre geçişi ve istilasının gerçek zamanlı ölçümü, tek bir zaman noktasında veri sağlayan geleneksel yöntemlere göre birden fazla, önemli avantajlara sahip basit, hızlı ve sürekli bir izleme işlemidir. Geleneksel yöntemlerde olduğu gibi, her hücre hattı gerçek zamanlı hücre analiz sistemi için her hücre hattı için en iyi duruma getirilmelidir, çünkü her hücre hattı substrat, büyüme, hücre-hücre temasları ve göç ve invaziv yete…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Olivia Funk’a gerçek zamanlı hücre analiz sistemi verilerine yaptığı teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Bu el yazması düzenleme için Çocuk Mercy Kansas City Tıp Yazma Merkezi teşekkür ederiz. Bu çalışma Tom Keaveny Endowed Fonu Pediatrik Kanser Araştırma (TP için) ve Çocuk Mercy Hastanesi Midwest Kanser İttifakı Ortak Danışma Kurulu fon (TP) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O’Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
