सी. एलिगेंस में शारीरिक तनाव प्रतिक्रियाओं के माप
Summary
यहां, हम फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर्स की सक्रियता को मापने और शारीरिक तनाव के प्रति संवेदनशीलता को परसकर निमाटोड सी एलिगेंस में सेलुलर प्रोटेओटॉक्सिक तनाव प्रतिक्रियाओं की विशेषता है।
Abstract
जीवअक्सर उतार-चढ़ाव वाले वातावरण और इंट्राकोशियलर होमोस्टोसिस में परिवर्तन के संपर्क में आते हैं, जिससे उनके प्रोटेम और फिजियोलॉजी पर हानिकारक प्रभाव पड़ सकते हैं। इस प्रकार, जीवों ने क्षति की मरम्मत और होमोस्टोसिस को बनाए रखने के लिए समर्पित लक्षित और विशिष्ट तनाव प्रतिक्रियाएं विकसित की हैं। इन तंत्रों में एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (यूपीआरईआर),माइटोकॉन्ड्रिया (यूपीआरएमटी),हीट शॉक रिस्पांस (एचएसआर), और ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस रिस्पांस (ऑक्सएसआर) की सामने आई प्रोटीन प्रतिक्रिया शामिल है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल इन रास्तों की सक्रियता और सूत्रकृमि, सी एलिगेंस में उनके शारीरिक परिणामों का पता लगाने और विशेषता के तरीकों का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, मार्ग-विशिष्ट फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर्स का उपयोग तेजी से सेलुलर लक्षण वर्णन, दवा स्क्रीनिंग, या बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीनिंग (जैसे, आरएनएआई या उत्परिवर्ती पुस्तकालयों) के लिए वर्णित है। इसके अलावा, पूरक, मजबूत शारीरिक परखों का वर्णन किया गया है, जिसका उपयोग विशिष्ट तनावों के लिए जानवरों की संवेदनशीलता का सीधे आकलन करने के लिए किया जा सकता है, जो प्रतिलेखन संवाददाताओं के कार्यात्मक सत्यापन के रूप में कार्य करते हैं। एक साथ, ये विधियां आंतरिक और बाहरी प्रोटेओटॉक्सिक क्षोभ के सेलुलर और शारीरिक प्रभावों के तेजी से लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देती हैं।
Introduction
अंतर और बाह्य वातावरण में परिवर्तन का जवाब देने के लिए एक जीव की क्षमता इसके अस्तित्व और अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण है। यह कई सुरक्षात्मक रास्तों के माध्यम से एक सेलुलर स्तर पर पूरा किया जाता है जो कोशिका की अखंडता सुनिश्चित करते हैं। जबकि कई सेलुलर घटक तनाव से जुड़े नुकसान के अधीन हैं, सेलुलर तनाव प्रतिक्रियाओं की एक प्रमुख भागीदारी सेलुलर प्रोटेम के होमोस्टोसिस की मरम्मत और रक्षा करना है। हालांकि, विशेष संरचनाओं में प्रोटीन का विभाजकीकरण, जिसे ऑर्गेनेल्स कहा जाता है, कोशिका के लिए एक चुनौती बन गया है, क्योंकि यह यह सुनिश्चित करने के लिए प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण के एक केंद्रीकृत रूप पर भरोसा नहीं कर सकता कि कोशिका के भीतर सभी प्रोटीन ठीक से मुड़ा हुआ और कार्यात्मक हो । इसलिए, अपने प्रोटीन के लिए क्षोभ से निपटने के लिए, ऑर्गेनेल्स ने समर्पित गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र विकसित किया है, जो गलत मुड़ा हुआ प्रोटीन समझ सकता है और उस डिब्बे के भीतर तनाव को कम करने के प्रयास में तनाव प्रतिक्रिया को सक्रिय कर सकता है। उदाहरण के लिए, साइटोसोल हीट शॉक रिस्पांस (एचएसआर) पर निर्भर करता है, जबकि एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) और माइटोकॉन्ड्रिया अपने डिब्बे-विशिष्ट सामने आए प्रोटीन प्रतिक्रियाओं (यूपीआर) पर भरोसा करते हैं। ऑक्सएसआर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के जहरीले प्रभावों को कम करने का कार्य करता है। प्रत्येक तनाव प्रतिक्रिया सेलुलर चुनौतियों और पर्यावरण अपमान की उपस्थिति में शुरू होता है और एक सिलवाया प्रतिलेखन प्रतिक्रिया लाती है । इन प्रतिक्रियाओं की पहचान में अणुओं का संश्लेषण शामिल है जो उचित ऑर्गेनेल को लक्षित गलत प्रोटीन (जैसे चैपरोन) को फिर से गुना करते हैं, या वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन क्षरण द्वारा क्षतिग्रस्त प्रोटीन को हटा देते हैं। इन तनाव प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करने में विफलता के परिणामस्वरूप क्षतिग्रस्त प्रोटीन का संचय होता है, ऊतकों की प्रणालीगत विफलता के लिए प्रचारित सेलुलर शिथिलता, और अंततः जीव की मृत्यु होती है। विभिन्न तनाव प्रतिक्रियाओं के कार्य और नियमन की कहीं और समीक्षा की जाती है1.
सेलुलर तनाव प्रतिक्रियाओं के विनियमन और गतिविधि के बारे में कई अंतर्दृष्टि नेमाटोड, Caenorhabditis elegans,आनुवंशिक अनुसंधान में एक बहुकोशिकीय मॉडल जीव के लिए जिंमेदार ठहराया गया है । सूत्रकृमि न केवल सेलुलर स्तर पर तनाव प्रतिक्रियाओं की सक्रियता का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं, बल्कि संगठित स्तर पर भी; सूत्रकृमि का उपयोग आनुवंशिक क्षोभ या दवाओं और प्रदूषकों के संपर्क में आने वाले प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया गया है। प्रयोग के दौरान उनका त्वरित पीढ़ी का समय, आइसोजेनी, पारदर्शिता, आनुवंशिक ट्रैकेबिलिटी और उपयोग में आसानी उन्हें ऐसे अध्ययनों के लिए आदर्श बनाती है। इसके अतिरिक्त, तनाव के लिए अपेक्षाकृत त्वरित शारीरिक प्रतिक्रिया (घंटे और कुछ दिनों के बीच) और सेलुलर रास्तों के विकासवादी संरक्षण तनाव प्रतिरोध का अध्ययन करने में एक प्रमुख उपकरण सूत्रकृमि बनाते हैं।
सी. एलिगेंसविकसित करने के लिए खाद्य स्रोत के रूप में उपयोग किए जाने वाले दो आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले ई कोलाई उपभेद हैं: मानक OP50, एक बी तनाव जिसमें सबसे अधिक प्रयोग ऐतिहासिक रूप से2 और HT115 किया गया है, एक K-12 तनाव जिसका उपयोग लगभग सभी आरएनएआई प्रयोगों3,,4के लिए किया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि OP50 और HT115 बैक्टीरियल आहार के बीच महत्वपूर्ण अंतर हैं। इन विभिन्न जीवाणु स्रोतों पर वृद्धि मेटाबोलिक प्रोफाइल, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए कॉपी संख्या, और उम्र5सहित कई प्रमुख फेनोटाइप में प्रमुख अंतर पैदा करने के लिए दिखाया गया है । इनमें से कुछ मतभेदों को OP50 बैक्टीरिया पर विकास से जुड़े विटामिन बी 12 की कमी के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रियल होमोस्टोसिस में दोष हो सकते हैं और रोगजनकों और तनावों के प्रति संवेदनशीलता बढ़ सकती है। इन सभी फेनोटाइप को HT115 बैक्टीरिया पर वृद्धि से समाप्त किया गया है, जिसमें विटामिन बी 126का उच्च स्तर है। इसलिए, यह सिफारिश की जाती है कि शारीरिक तनाव प्रतिक्रियाओं पर सभी प्रयोग ों को RNAI स्थितियों की आवश्यकता की परवाह किए बिना HT115 बैक्टीरिया पर किया जाए। हालांकि, OP50 पर जानवरों को बनाए रखने में आसानी के कारण, सभी मानक विकास (यानी, रखरखाव और जानवरों के प्रवर्धन) OP50 पर किया जा सकता है, के रूप में यहां वर्णित प्रयोगात्मक प्रतिमान में महत्वपूर्ण अंतर OP50 पर बनाए रखा कीड़े में पता नहीं चला जब तक वे HT115 पोस्ट सिंक्रोनाइजेशन (यानी, के साथ या L1 गिरफ्तार करने के बिना ब्लीचिंग के बाद से ले जाया गया) प्रयोग तक ।
यहां, दो कार्यात्मक तरीकों का उपयोग करके सेलुलर तनाव प्रतिक्रियाओं की गतिविधि का लक्षण वर्णन वर्णित है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रस्तुत प्रोटोकॉल मुख्य रूप से सेलुलर तनाव प्रतिक्रियाओं और प्रोटीन होमोस्टोसिस पर उनके प्रभाव पर केंद्रित हैं। सबसे पहले, फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर्स का उपयोग किया जाता है, जिन्हें एंडोजेनस जीन प्रमोटरों द्वारा विनियमित किया जाता है जो विशेष रूप से विभिन्न सेलुलर तनावों के जवाब में सक्रिय होते हैं। ये फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनियल रिपोर्टर विशिष्ट जीन के प्रतिलेखन प्रेरण पर आधारित हैं जो मूल रूप से तनाव प्रतिक्रिया का हिस्सा हैं। उदाहरण के लिए, HSP-4, मानव chaperone HSPA5/BiP के लिए एक हीट शॉक प्रोटीन ऑर्थोलॉगस, ईआर-तनाव पर सक्रिय है और तनाव को कम करने के लिए ईआर को स्थानीयकरण करता है । ईआर तनाव (उदाहरण के लिए, ट्यूनिकामाइसिन के संपर्क में), एचएसपी-4 प्रमोटर के नियमन के तहत रखा गया एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की स्थितियों में, उच्च स्तर में संश्लेषित किया जाता है जैसा कि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है या मात्रात्मक रूप से नेमाटोड7के बड़े कण प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके मापा जा सकता है। इसी तरह, एक माइटोकॉन्ड्रियल चैपरोन के प्रमोटर, एचएसपी-6 (ऑर्थोलॉगस टू स्तनधारी एचएसपीए9) का उपयोग यूपीआरएमटी8की सक्रियता की निगरानी के लिए किया जाता है, और साइटोसोलिक चैपरोन एचएस-16.2 (मानव क्रिस्टलिन अल्फा जीन के लिए ऑर्थोलोगस) के प्रमोटर का उपयोग एचएसआर9की गतिविधि का आकलन करने के लिए किया जाता है। ये रिपोर्टर विभिन्न क्षोभ के जवाब में सक्रिय रास्तों के तेजी से लक्षण वर्णन की अनुमति देते हैं ।
अक्सर, यहां प्रस्तुत संवाददाताओं माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि रहे हैं, जो तनाव प्रतिक्रियाओं की सक्रियता का गुणात्मक उत्पादन प्रदान करता है । हालांकि, जबकि इमेजिंग तकनीक ऊपर वर्णित संवाददाताओं की तीव्रता और ऊतक स्थान के बारे में दोनों जानकारी प्रदान करते हैं, इसकी मात्रा हमेशा सटीक या मजबूत नहीं है । हालांकि इमेजिंग विश्लेषण उपकरणों का उपयोग करके फ्लोरोसेंट सक्रियण की मात्रा निर्धारित करना संभव है, ये विधियां अपेक्षाकृत कम हैं और नमूना आकार कम है, छवि वाले जानवरों की अपेक्षाकृत कम संख्या के कारण। जानवरों की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने की आसानी और क्षमता जल्दी सी एलिगेंस को एक बड़े कण प्रवाह साइटोमीटर के उपयोग के माध्यम से फ्लोरोसेंट तनाव संवाददाताओं की सक्रियता को परखने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली बनाती है। एक बड़े कण प्रवाह साइटोमीटर कई जीवित जानवरों से आकार और फ्लोरेसेंस के आधार पर रिकॉर्डिंग, विश्लेषण और छंटाई करने में सक्षम है। इस विधि का उपयोग करके, हजारों कीड़े के लिए फ्लोरोसेंट तीव्रता, आकार और स्थानिक (2डी) जानकारी प्राप्त करना संभव है। सिस्टम को फ्लोपायलट का उपयोग करके नियंत्रित किया जाता है, जो वास्तविक समय डेटा अधिग्रहण और मापा मापदंडों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। यहां, एक बड़े कण प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करसूक्ष्म इमेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण दोनों के लिए तरीकों को तनाव प्रतिक्रियाओं की सक्रियता को मापने के तरीकों के रूप में पेश किया जाता है।
रिपोर्टर विश्लेषण से परे, संवेदनशीलता या तनाव के लिए जानवरों के प्रतिरोध शारीरिक तनाव परख का उपयोग कर मापा जा सकता है । यह जानवरों को तनावपूर्ण वातावरण में उजागर करके हासिल किया जाता है जो विशिष्ट सेलुलर तनाव मार्गों को सक्रिय करते हैं। यहां, विशिष्ट प्रकार के तनावों के लिए पूरे जानवरों की संवेदनशीलता को मापने के लिए कई तरीके प्रदान किए जाते हैं।
ईआर तनाव रासायनिक एजेंट, ट्यूनिकामाइसिन का उपयोग करके सी एलिगेंस पर लागू किया जाता है, जो एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन को ब्लॉक करता है, जिससे ईआर10में गलत मुड़ा हुआ प्रोटीन का संचय होता है। सी एलिगेंसमें, ट्यूनिकामाइसिन के संपर्क में आने पर वृद्धि ईआर फ़ंक्शन में प्रमुख क्षोभ में होती है, औरउम्र 11में काफी कम हो जाती है। ट्यूनिकामाइसिन युक्त प्लेटों पर जानवरों के अस्तित्व को मापने से, जानवरों की ईआर तनाव संवेदनशीलता की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। उदाहरण के लिए, एक्टोपिक यूपीआरईआर प्रेरण वाले जानवरऔर इस प्रकार ईआर में प्रोटीन गलत मोड़ तनाव के प्रतिरोध में वृद्धि से जंगली प्रकार के जानवरों की तुलना में ट्यूनिकामाइसिन एक्सपोजर पर अस्तित्व बढ़ गया है12।
ऑक्सीडेटिव और माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस को केमिकल एजेंट, पैराक्विट में जानवरों को उजागर करके सी एलिगेंस पर लगाया जाता है। पैराक्विट आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला शाकनाशी होता है, जो विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रिया13में सुपरऑक्साइड गठन का कारण बनता है। माइटोकॉन्ड्रिया-व्युत्पन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के विशिष्ट स्थानीयकरण के कारण, पैराक्विट परख ों का उपयोग अक्सर “माइटोकॉन्ड्रियल” तनाव परख के रूप में किया जाता है। हालांकि, सुपरऑक्साइड को माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड डिमुटेस (एसओडी)14द्वारा तेजी से हाइड्रोजन पेरोक्साइड में परिवर्तित किया जाता है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड बाद में माइटोकॉन्ड्रिया से बाहर निकल सकता है और कोशिका के अन्य डिब्बों में ऑक्सीडेटिव तनाव पैदा कर सकता है। इसलिए, हम माइटोकॉन्ड्रियल और ऑक्सीडेटिव तनाव (अन्य ऑक्सीडेटिव तनाव के सखोंको 15पाया जा सकता है) दोनों के प्रति संवेदनशीलता को मापने के रूप में पैराक्विट अस्तित्व के परखों का वर्णन करते हैं।
थर्मोटॉलरेंस परखों को ऊंचा तापमान में जानवरों को रखकर सी एलिगेंस में किया जाता है । नेमाटोड के लिए परिवेश का तापमान ~ 15-20 डिग्री सेल्सियस होता है और थर्मल तनाव 25 डिग्री सेल्सियस16,17से ऊपर के तापमान पर प्रेरित होता है। थर्मोटॉलरेंस परख आम तौर पर 30-37 डिग्री सेल्सियस से लेकर तापमान पर किया जाता है, क्योंकि जानवर इस तापमान पर प्रमुख सेलुलर दोषों का प्रदर्शन करते हैं, और जीवित रहने के परख24 घंटे16, 18,केभीतर पूरी हो जाते हैं। यहां थर्मोटॉलरेंस के प्रदर्शन के लिए दो वैकल्पिक तरीके बताए गए हैं- 34 डिग्री सेल्सियस पर विकास और 37 डिग्री सेल्सियस पर विकास। एक साथ, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर स्क्रीन प्रदर्शन जब मानक जीन दस्तक के साथ संयुक्त आरएनए हस्तक्षेप या रासायनिक दवा पुस्तकालयों का उपयोग कर नीचे का उपयोग किया जा सकता है ।
प्रोटोकॉल को 4 व्यापक प्रक्रियाओं में तोड़ा जा सकता है- सी एलिगन्स का विकास और इमेजिंग (सेक्शन 1 और 2) की तैयारी, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (सेक्शन 3-5) का उपयोग करके ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर्स की इमेजिंग, बड़े कण प्रवाह साइटोमीटर (धारा 6) का उपयोग करके संवाददाताओं का मात्रात्मक माप, और सी लेगन (सेक्शन 7) में तनाव संवेदनशीलता को मापने के लिए शारीरिक रूप।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, सी एलिगेंसमें सेलुलर तनाव प्रतिक्रियाओं से पूछताछ करने के तरीकों, फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर्स और शारीरिक तनाव अस्तित्व परख ों का उपयोग करके वर्णित हैं। संवाददाताओं सभी GFP बढ़ते स…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.BZ। EMBO दीर्घकालिक फैलोशिप और लैरी एल हिलब्लोम फाउंडेशन द्वारा समर्थित है। आरएचएस को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एजिंग (एनआईए) और ग्लेन फाउंडेशन फॉर मेडिकल रिसर्च पोस्टडॉक्टोरल फेलोशिप के माध्यम से अनुदान 5F32AG032023-02 द्वारा समर्थित है । A.F. एनआईए के माध्यम से अनुदान F32AG051355 द्वारा समर्थित है । एच.के.जी. को नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप प्रोग्राम के माध्यम से अनुदान DGE1752814 द्वारा समर्थित किया जाता है। एम.जी.एम. एनआईए के माध्यम से 1F31AG060660-01 द्वारा समर्थित है। ईस्वी थॉमस और स्टेसी सिबेल फाउंडेशन, हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट, और 4R01AG042679-04 और 5R01AG055891-02 एनआईए से, और 5R01ES021667-09 NIEHS से समर्थित है । हम महत्वपूर्ण तकनीकी सहायता के लिए लैरी जो, मेलिसा सांचेज, नामे केलेट और एनेल एस्क्विवेल का शुक्रिया अदा करते हैं । हम उपभेदों के लिए मोरिमोटो लैब और सीजीसी (अनुसंधान बुनियादी ढांचे के कार्यक्रम P40 OD010440 के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित) का शुक्रिया अदा करते हैं।
Materials
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | for mitochondrial stress |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118072 | for NGM plates |
| BD Difco granulated agar | VWR | 90000-782 | for NGM plates |
| Calcium chloride dihydrate | VWR | 97061-904 | for NGM plates |
| Carbenicillin | BioPioneer | C0051-25 | for RNAi |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | for NGM plates |
| COPAS Biosorter | Union Biometrica | 350-5000-000 | equipped with a 488 nm light source. |
| COPAS Cleaning Solution | Union Biometrica | 300-5072-000 | to use with COPAS |
| COPAS Sheath Solution | Union Biometrica | 300-5070-100 | to use with COPAS |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | solvent for drugs |
| IPTG dioxane free | Denville Scientific | CI8280-4 | for RNAi |
| LB Broth Miller | Fisher Scientific | BP1426500 | for LB |
| M205FA stereoscope | Leica | 10450040 | equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-3 | for NGM plates, M9 |
| Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | for oxidative/mitochondrial stress |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | for bleach soluton |
| Potassium phosphate dibasic | VWR | EM-PX1570-2 | for NGM plates |
| Potassium phosphate monobasic | VWR | EM-PX1565-5 | for M9 |
| Revolve | ECHO | 75990-514 | equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 71289-50G | for imaging |
| Sodium Chloride | EMD Millipore | SX0420-5 | for NGM plates, M9 |
| Sodium phosphate dibasic | VWR | 71003-472 | for M9 |
| Tert-butyl hydroperoxide | Sigma-Aldrich | 458139 | for oxidative stress |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | for RNAi |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | for ER stress |
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