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Biologie

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

Published: May 21, 2020
doi:
10.3791/61001
, , , , , , ,
1Department of Molecular and Cell Biology,University of California, Berkeley

Summary

여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.

Abstract

유기체는 종종 변동 환경과 세포 내 항상성에 변화에 노출, 이는 자신의 단백질과 생리학에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 유기체는 손상을 복구하고 항상성을 유지하기 위해 최선을 다하고 대상 및 특정 스트레스 응답을 진화했다. 이러한 메커니즘은 내구 성 망막(UPRER),미토콘드리아의 전개된 단백질 반응(UPRMT),열 충격 반응(HSR) 및 산화 스트레스 반응(OxSR)의 전개된 단백질 반응을 포함한다. 여기에 제시 된 프로토콜은 선충, C. elegans에서이러한 경로및 생리적 결과의 활성화를 감지하고 특성화하는 방법을 설명합니다. 먼저, 경로 특이적 형광 전사 기의 사용은 신속한 세포 특성화, 약물 스크리닝, 또는 대규모 유전자 스크리닝(예를 들어, RNAi 또는 돌연변이 라이브러리)에 대해 기술된다. 또한, 상보적이고 견고한 생리학적 측정이 설명되며, 이는 특정 스트레스에 대한 동물의 민감도를 직접 평가하는 데 사용될 수 있으며, 전사 기의 기능적 검증역할을 한다. 함께, 이러한 방법은 내부 및 외부 proteotoxic 섭동의 세포 및 생리적 효과의 신속한 특성화를 허용합니다.

Introduction

세포 내 및 세포 외 환경의 변화에 반응하는 유기체의 능력은 생존과 적응에 매우 중요합니다. 이것은 세포의 무결성을 보장하는 수많은 보호 경로를 통해 세포 수준에서 수행됩니다. 수많은 세포 구성 요소는 스트레스 관련 손상의 대상이 되는 동안, 세포 스트레스 응답의 한 가지 주요 참여는 복구 하 고 세포 proteome의 항상성을 보호 하는. 그러나, 세포기관에게 불린 특별한 구조물로 단백질의 구획화는, 세포 내의 모든 단백질이 제대로 접혀 있고 기능적이다는 것을 확인하기 위하여 단백질 품질 관리의 1개의 중앙 집중식 양식에 의지할 수 없기 때문에, 세포를 위한 도전을 제기합니다. 따라서, 그들의 단백질에 교란을 다루기 위하여는, 세포기관은 잘못 접힌 단백질을 감지하고 그 구획 내의 응력을 경감하기 위하여 시도에서 긴장 반응을 활성화할 수 있는 전용적인 품질 관리 기계장치를 발전시켰습니다. 예를 들어, 시토솔은 열 충격 반응(HSR)에 의존하는 반면, 내포성 망상체(ER)와 미토콘드리아는 구획특이적 전개단백질 반응(UPR)에 의존한다. OxSR 반응성 산소 종의 독성 효과 완화 하는 역 (ROS). 각 스트레스 반응은 세포 도전과 환경 모욕의 존재에서 트리거되고 맞춤형 전사 반응을 유도한다. 이 반응의 특징은 적당한 세포기관을 표적으로 한 잘못 접힌 단백질 (샤페론과 같은) 또는 대안으로, 단백질 분해에 의해 손상된 단백질을 제거하는 분자를 합성하는 것을 포함합니다. 이러한 스트레스 반응을 활성화 하지 못하면 손상된 단백질의 축적, 조직의 전신 장애로 전파 되는 세포 기능 장애, 그리고 결국 유기체의 죽음. 다른 스트레스 응답의 기능과 조절은다른곳에서 검토1 .

세포 스트레스 반응의 조절 및 활동에 관한 많은 통찰력은 선충, 예쁜꼬마선충,유전 연구에서 다세포 모델 유기체에 기인했습니다. 선충은 세포 수준에서 스트레스 반응의 활성화를 연구 할뿐만 아니라 유기체 수준에서도 연구 할 수 있습니다. 선충은 그들의 성장과 생존에 있는 약 및 오염물질에 유전 섭동 또는 노출의 효력을 공부하기 위하여 이용되었습니다. 그들의 빠른 생성 시간, 등소, 투명성, 유전 적 견인성 및 실험 중 사용 편의성은 그러한 연구에 이상적입니다. 또한, 스트레스에 상대적으로 빠른 생리 적 반응 (시간과 몇 일 사이) 그리고 세포 경로의 진화 보존 선충 스트레스 저항을 공부에 눈에 띄는 도구.

C. elegans를성장 하기 위해 식품 소스로 사용 되는 두 개의 일반적으로 사용 되는 대장균 균주가 있다: 표준 OP50, 대부분의 실험역사적으로 수행 된 B 변형2 그리고 HT115, 거의 모든 RNAi실험에사용 되는 K-12 균주3,4. OP50과 HT115 세균성 규정식 사이 중요한 다름이 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 이 상이한 세균 성 근원에 성장은 신진 대사 단면도에 있는 중요한 다름을 일으키는 원인이 되기 위하여 보였습니다, 미토콘드리아 DNA 사본 수, 및 수명을 포함하여 몇몇 중요한 표현형, 일생5. 이러한 차이 중 일부는 OP50 박테리아에 성장과 관련 된 비타민 B12 결핍에 기인, 미토 콘 드리 아 항상성 및 병원 체와 스트레스에 증가 감도 발생할 수 있습니다. 이러한 표현형의 모든 HT115 박테리아에 성장에 의해 완화 될 것으로 나타났습니다., 비타민 B12의 상부는6. 따라서 RNAi 조건의 필요성에 관계없이 HT115 박테리아에 대한 생리적 스트레스 반응에 대한 모든 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 그러나, OP50상에서 동물을 유지하기 가용하기 때문에, 모든 표준 성장(즉, 동물의 유지 보수 및 증폭)은 OP50에서 수행될 수 있으며, 여기에 설명된 실험 패러다임의 현저한 차이는 OP50에서 유지되는 웜에서 검출되지 않았으며, HT115 포스트 동기화(즉, 부화 후 표백으로부터 또는 L검치없이)

여기서, 두 가지 기능적 방법을 이용한 세포 스트레스 반응의 활성의 특성화가 설명된다. 제시된 프로토콜은 주로 세포 스트레스 반응과 단백질 항상성에 미치는 영향에 초점을 맞추고 있다는 점에 유의해야합니다. 첫째, 형광 전사 기자는 다른 세포 스트레스에 응하여 특별히 활성화되는 내인성 유전자 프로모터에 의해 조절되는 활용된다. 이러한 형광 전사 기자는 기본적으로 스트레스 반응의 일부인 특정 유전자의 전사 유도에 기초한다. 예를 들어, HSP-4는 인간 보호자 HSPA5/BiP에 대한 열 충격 단백질 정형고체로, ER 스트레스시 활성화되고 스트레스를 완화하기 위해 ER에 국소화됩니다. ER 스트레스(예를 들어, tunicamycin에 대한 노출)의 조건에서, hsp-4 프로모터의 조절하에 놓인 녹색 형광 단백질(GFP)은,선충7의대입자 유동 세포학을 사용하여 형광 현미경 또는 정량적으로 측정될 수 있는 바와 같이 높은 수준으로 합성된다. 유사하게, 미토콘드리아 샤페론의 프로모터, hsp-6(포유류 HSPA9에 직교), UPRMT8의활성화를 모니터링하는 데 이용되고, 세포질 샤페론 hsp-16.2의 프로모터는 HSR9의활성을 평가하는데 사용된다. 이 리포터는 다양한 섭동에 대한 응답으로 활성화 된 경로의 신속한 특성화를 허용합니다.

종종 여기에 제시 된 기자는 스트레스 반응의 활성화의 질적 인 출력을 제공하는 현미경 검사를 사용하여 이미지화됩니다. 그러나 이미징 기술은 위에서 설명한 기자의 강도와 조직 위치에 대한 정보를 모두 제공하지만 정량화가 항상 정확하거나 견고한 것은 아닙니다. 이미징 분석 도구를 사용하여 형광 활성화를 정량화할 수 있지만, 이러한 방법은 상대적으로 처리량이 낮고 샘플 크기가 작으며, 이는 상대적으로 적은 수의 동물이 이미지화되기 때문이다. 다량의 동물을 쉽게 얻을 수있는 능력은 C. elegans가 큰 입자 유동 세포계를 사용하여 형광 응력 리포터의 활성화를 분석하는 이상적인 모델 시스템입니다. 큰 입자 유동 세포계는 많은 살아있는 동물의 크기와 형광에 따라 기록, 분석 및 분류 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 수천 개의 웜에 대한 형광 강도, 크기 및 공간(2D) 정보를 얻을 수 있습니다. 이 시스템은 FlowPilot을 사용하여 제어되며, 이를 통해 측정된 파라미터를 실시간으로 데이터 수집 및 분석할 수 있습니다. 여기서, 대입자 유동 세포계를 이용한 현미경 이미징 및 정량분석 방법 모두 응력 반응의 활성화를 측정하는 방법으로 제안된다.

리포터 분석 외에도 동물의 스트레스에 대한 민감도 또는 저항성을 생리적 스트레스 분석법으로 측정할 수 있습니다. 이것은 특정 세포 스트레스 경로를 활성화 스트레스 환경에 동물을 노출하여 달성된다. 여기서, 특정 유형의 스트레스에 대한 전체 동물의 민감도를 측정하기 위한 몇 가지 방법이 제공된다.

ER 응력은 N-연결된 글리코실화를 차단하는 화학 약제인 튜니카마이신을 사용하여 C. elegans에 가해져 ER10에서잘못 접힌 단백질이 축적됩니다. C. 예쁜꼬마선충에서튜니카마이신에 노출되면 성장하면 ER 기능의 주요 섭동이 발생하며 수명이 현저히 감소하여수명이 11로크게 감소합니다. 튜니카마이신 함유 플레이트에서 동물의 생존을 측정함으로써, 동물의 ER 응력 민감도를 정량화할 수 있다. 예를 들어, 이후성 UPRER 유도를 가진 동물은 ER에서 단백질 오폴딩 스트레스에 대한 내성을 증가시켜 야생형동물(12)에비해 튜니카마이신 노출 시 생존율이 증가한다.

산화 및 미토콘드리아 스트레스는 동물을 화학 약제인 파라쿼트에 노출시킴으로써 C. 예쁜꼬마선충에 가된다. 파라쿼트(Paraquat)는 일반적으로 사용되는 제초제로서, 특히 미토콘드리아13에서과산화물 형성을 일으킨다. 미토콘드리아 유래 반응성 산소 종(ROS)의 특이적 국소화로 인해 파라쿼트 분석제는 종종 “미토콘드리아” 스트레스 분석법으로 사용됩니다. 그러나, 과산화물은 미토콘드리아 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SODs)14에의해 과산화수소로 급속히 전환된다. 과산화수소는 이후에 미토콘드리아에서 확산되어 세포의 다른 구획에서 산화 스트레스를 유발할 수 있습니다. 따라서, 우리는 미토콘드리아 및 산화 스트레스 둘 다에 대한 감수성을 측정하는 것으로 파라쿼트 생존 분석을 설명한다(다른 산화 스트레스측정제는 15).

열내성 검사들은 동물을 높은 온도에 두어 C. 예쁜꼬마선충에서 수행됩니다. 선충에 대한 주변 온도는 ~ 15-20 °C이며 열 응력은 25 °C16,,17이상의 온도에서 유도됩니다. 열내성 측정은 일반적으로 동물이 이 온도에서 중요한 세포 결함을 나타내기 때문에 30-37 °C에 이르는 온도에서 수행되며, 생존 측정은 24 시간16,,18이내에 완료됩니다. 여기서, 열내성 검사를 수행하기 위한 두 가지 대체 방법이 제공된다: 34°C에서의 성장 및 37°C에서의 성장. 함께, 여기에 제시된 프로토콜은 RNA 간섭 또는 화학 약물 라이브러리를 사용하여 표준 유전자 노크다운과 결합될 때 대규모 스크린을 수행하기 위해 이용될 수 있다.

프로토콜은 4 개의 넓은 절차로 나눌 수 있습니다- C. elegans의 성장 및 화상 진찰을 위한 준비 (단면도 1 및 2), 형광 현미경 검사법을 사용하여 전사 기자의 화상 진찰 (섹션 3-5), 큰 입자 유량 세포측계를 사용하여 기자의 정량적인 측정 (섹션 6), 및 C. elegans에 있는 긴장 감도를 측정하기 위하여 생리학적 분석 (단면도 7).

Protocol

1. 온도 및 OP50 대 HT115의 표준 성장 조건 표준 성장 및 확장 LB(표 1)에서OP50의 배양물을 성장시키고 주변 온도(~22-25°C)에서 24-48시간 동안 이에 상응하는 매체를 선택한다. OP50은 우라실 보조트로프로서 실온에서 박테리아를 성장시키고 37°C에서 재배할 때 역류제(예를 들어, 억제기 돌연변이체)의 발생률이 더 높다. OP50 배양물의 장기 보관은 권장되지 않습니다(최대 1주~4°…

Representative Results

전사 리포터를 사용하여 스트레스 반응 의 활성화를 측정여기에서, 형광 전사 기자는 C. elegans에있는 대부분의 긴장 반응의 활성화를 측정하는 강력한 공구로 봉사하는 이용됩니다. GFP 발현은 구획별 응력에 반응하는 데 관여하는 마스터 전사 조절제의 정식 표적의 프로모터에 의해 구동된다. 일반적으로 사용되는 전사 기자의 포괄적인 목록은 <stron…

Discussion

여기서, C. elegans에서세포 스트레스 반응을 심문하는 방법, 형광 전사 리포터 및 생리적 스트레스 생존 측정법을 사용하여 설명된다. 기자들은 모두 세포 스트레스 반응 장착에 관여하는 전사 인자의 다운스트림 전사 표적의 프로모터 하에 구동되는 GFP 발현을 이용한다. hsp-4p의 사용 ::GFP는 XBP-1s 매개 UPRER에의해 변조, hsp-6p ::GFP ATFS-1 중재 UPRMT에의해 제어, GST…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R.BZ. EMBO 장기 펠로우십과 래리 L. 힐블롬 재단의 지원을 받고 있습니다. R.H.S는 국립 노화 연구소 (NIA)와 의학 연구 박사 후 펠로우십을위한 글렌 재단을 통해 보조금 5F32AG032023-02에 의해 지원됩니다. A.F.는 NIA를 통해 F32AG051355를 지원합니다. 에이치케이지는 국립과학재단 대학원 연구동호회 프로그램을 통해 DGE1752814를 지원하고 있습니다. M.G.M.은 NIA를 통해 1F31AG060660-01에 의해 지원됩니다. A.D.는 토마스와 스테이시 시벨 재단, 하워드 휴즈 의학 연구소, 4R01AG042679-04 및 NIA의 5R01AG055891-02, 그리고 NIEHS의 5R01ES021667-09에 의해 지원됩니다. 래리 조, 멜리사 산체스, 나메 켈렛, 아넬 에스퀴벨에게 상당한 기술적 지원을 부탁드립니다. 우리는 모리모토 연구소와 CGC (연구 인프라 프로그램 P40 OD010440의 NIH 사무실에 의해 투자) 균주에 감사드립니다.

Materials

Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 for mitochondrial stress
Bacto Peptone Fisher Scientific DF0118072 for NGM plates
BD Difco granulated agar VWR 90000-782 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin BioPioneer C0051-25 for RNAi
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 for NGM plates
COPAS Biosorter Union Biometrica 350-5000-000 equipped with a 488 nm light source.
COPAS Cleaning Solution Union Biometrica 300-5072-000 to use with COPAS
COPAS Sheath Solution Union Biometrica 300-5070-100 to use with COPAS
DMSO Sigma-Aldrich 472301 solvent for drugs
IPTG dioxane free Denville Scientific CI8280-4 for RNAi
LB Broth Miller Fisher Scientific BP1426500 for LB
M205FA stereoscope Leica 10450040 equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software
Magnesium sulfate heptahydrate VWR EM-MX0070-3 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride Fisher P217-500 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
Revolve ECHO 75990-514 equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software
Sodium Azide Sigma-Aldrich 71289-50G for imaging
Sodium Chloride EMD Millipore SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tert-butyl hydroperoxide Sigma-Aldrich 458139 for oxidative stress
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660-5G for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress
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References

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Citer Cet Article
Bar-Ziv, R., Frakes, A. E., Higuchi-Sanabria, R., Bolas, T., Frankino, P. A., Gildea, H. K., Metcalf, M. G., Dillin, A. Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans. J. Vis. Exp. (159), e61001, doi:10.3791/61001 (2020).
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