Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans
Summary
Aqui, caracterizamos as respostas de estresse proteotóxico celular no nematoide C. elegans medindo a ativação de repórteres transcritores fluorescentes e atribuindo sensibilidade ao estresse fisiológico.
Abstract
Organismos são frequentemente expostos a ambientes flutuantes e mudanças na homeostase intracelular, que podem ter efeitos prejudiciais em seu proteome e fisiologia. Assim, os organismos evoluíram respostas de estresse direcionadas e específicas dedicadas a reparar danos e manter a homeostase. Esses mecanismos incluem a resposta proteica desdobrada do retículo endoplasmático (UPRER),a resposta proteica desdobrada das mitocôndrias (UPRMT),a resposta ao choque térmico (HSR) e a resposta ao estresse oxidativo (OxSR). Os protocolos aqui apresentados descrevem métodos para detectar e caracterizar a ativação dessas vias e suas consequências fisiológicas no nematoide, C. elegans. Em primeiro lugar, o uso de repórteres transcritores fluorescentes específicos da via é descrito para caracterização celular rápida, triagem de drogas ou triagem genética em larga escala (por exemplo, RNAi ou bibliotecas mutantes). Além disso, são descritos ensaios fisiológicos complementares e robustos, que podem ser utilizados para avaliar diretamente a sensibilidade dos animais a estressores específicos, servindo como validação funcional dos repórteres transcritores. Juntos, esses métodos permitem a rápida caracterização dos efeitos celulares e fisiológicos das perturbações proteotóxicas internas e externas.
Introduction
A capacidade de um organismo de responder a mudanças no ambiente intra e extracelular é crucial para sua sobrevivência e adaptação. Isso é feito em nível celular através de numerosas vias de proteção que garantem a integridade da célula. Embora numerosos componentes celulares estejam sujeitos a danos associados ao estresse, um grande envolvimento das respostas ao estresse celular é reparar e proteger a homeostase do proteome celular. No entanto, a compartimentação de proteínas em estruturas especiais, chamadas organelas, representa um desafio para a célula, pois não pode contar com uma forma centralizada de controle de qualidade proteica para garantir que todas as proteínas dentro da célula sejam devidamente dobradas e funcionais. Portanto, para lidar com perturbações de suas proteínas, organelas desenvolveram mecanismos dedicados de controle de qualidade, que podem sentir proteínas desdobradas e ativar uma resposta ao estresse na tentativa de aliviar o estresse dentro desse compartimento. Por exemplo, o citosol depende da resposta ao choque térmico (HSR), enquanto o retículo endoplasmático (ER) e mitocôndrias dependem de suas respostas proteicas desdobradas específicas do compartimento (UPR). O OxSR serve para aliviar os efeitos tóxicos das espécies de oxigênio reativa (ROS). Cada resposta ao estresse é desencadeada na presença de desafios celulares e insultos ambientais e induz uma resposta transcricional sob medida. As marcas dessas respostas incluem sintetizar moléculas que redobram proteínas desdobradas (como acompanhantes) direcionadas à organela adequada, ou, alternativamente, remover proteínas danificadas pela degradação proteica. A falha em ativar essas respostas de estresse resulta no acúmulo de proteínas danificadas, disfunção celular propagada para falha sistêmica dos tecidos e, eventualmente, morte do organismo. A função e a regulação das diferentes respostas ao estresse são revisadas em outros lugares1.
Muitos insights sobre a regulação e atividade das respostas ao estresse celular foram atribuídos ao nematode, Caenorhabditis elegans, um organismo modelo multicelular em pesquisa genética. Os nematóides não só permitem estudar a ativação das respostas ao estresse no nível celular, mas também no nível organismo; nematóides têm sido usados para estudar os efeitos de perturbações genéticas ou exposição a drogas e poluentes em seu crescimento e sobrevivência. Seu tempo de geração rápida, isogenia, transparência, trabilidade genética e facilidade de uso durante a experimentação os tornam ideais para tais estudos. Além disso, a resposta fisiológica relativamente rápida ao estresse (entre horas e poucos dias) e a conservação evolutiva das vias celulares fazem dos nematóides uma ferramenta proeminente no estudo da resistência ao estresse.
Existem duas cepas de E. coli comumente usadas como fonte de alimento para cultivar C. elegans: padrão OP50, uma cepa B na qual a maioria das experimentações foi historicamente realizada2 e HT115, uma cepa K-12 que é usada para quase todos os experimentos RNAi3,4. É importante notar que existem diferenças significativas entre as dietas bacterianas OP50 e HT115. O crescimento dessas diferentes fontes bacterianas tem sido demonstrado para causar grandes diferenças no perfil metabólico, número de cópia de DNA mitocondrial e vários dos principais fenótipos, incluindo a vida útil5. Algumas dessas diferenças são atribuídas à deficiência de Vitamina B12 associada ao crescimento das bactérias OP50, o que pode resultar em defeitos na homeostase mitocondrial e aumento da sensibilidade a patógenos e estresses. Todos esses fenótipos têm sido amenizados pelo crescimento das bactérias HT115, que têm níveis mais elevados de Vitamina B126. Portanto, recomenda-se que todos os experimentos em respostas fisiológicas ao estresse sejam realizados em bactérias HT115, independentemente da necessidade das condições rnai. No entanto, devido à facilidade de manutenção de animais na OP50, todo o crescimento padrão (ou seja, manutenção e amplificação de animais) pode ser realizado na OP50, uma vez que diferenças significativas nos paradigmas experimentais descritos aqui não foram detectadas em vermes mantidos na OP50 desde que fossem transferidos para HT115 pós-sincronização (ou seja, de eclosão pós-branqueamento com ou sem L1) até a experimentação.
Aqui, é descrita a caracterização da atividade das respostas ao estresse celular utilizando dois métodos funcionais. Deve-se notar que os protocolos apresentados são focados principalmente nas respostas ao estresse celular e seu impacto na homeostase proteica. Em primeiro lugar, são utilizados repórteres transcricionais fluorescentes, que são regulados por promotores genéticos endógenos que são especificamente ativados em resposta a diferentes tensões celulares. Esses repórteres transcritores fluorescentes baseiam-se na indução transcricional de genes específicos que fazem parte nativamente da resposta ao estresse. Por exemplo, hSP-4, um ortologode de proteína de choque térmico para a acompanhante humana HSPA5/BiP, é ativado sobre o estresse er e localiza-se para o ER para aliviar o estresse. Em condições de estresse er (por exemplo, exposição à tnicamicina), uma proteína fluorescente verde (GFP), colocada sob a regulação do promotor hsp-4, é sintetizada em altos níveis, como pode ser avaliada por microscopia fluorescente ou quantitativamente medida utilizando citometria de fluxo de partículas grandes de nematóides7. Da mesma forma, utiliza-se o promotor de um acompanhante mitocondrial, hsp-6 (ortologos a mamíferos HSPA9), para monitorar a ativação do UPRMT8, e o promotor da acompanhante citossólica hsp-16.2 (ortologous aos genes alfa cristalino humano) é utilizado para avaliar a atividade do HSR9. Esses repórteres permitem uma rápida caracterização dos caminhos ativados em resposta a várias perturbações.
Muitas vezes, os repórteres aqui apresentados são imagem do uso de microscopia, que fornece uma saída qualitativa da ativação de respostas ao estresse. No entanto, embora as técnicas de imagem forneçam informações sobre a intensidade e a localização do tecido dos repórteres descritos acima, sua quantificação nem sempre é precisa ou robusta. Embora seja possível quantificar a ativação fluorescente usando ferramentas de análise de imagem, esses métodos são relativamente baixos de throughput e o tamanho da amostra é pequeno, devido ao número relativamente baixo de animais com imagem. A facilidade e a capacidade de obter grandes quantidades de animais rapidamente fazem de C. elegans um sistema de modelo ideal para medir a ativação de repórteres de estresse fluorescente através do uso de um grande citómetro de fluxo de partículas. Um citómetro de fluxo de partículas grandes é capaz de registrar, analisar e classificar com base no tamanho e fluorescência de muitos animais vivos. Usando este método, é possível obter a intensidade fluorescente, tamanho e também informações espaciais (2D) para milhares de vermes. O sistema é controlado utilizando o FlowPilot, que permite a aquisição e análise de dados em tempo real dos parâmetros medidos. Aqui, métodos para imagens microscópicas e análise quantitativa usando um citómetro de fluxo de partículas de grande porte são oferecidos como métodos para medir a ativação das respostas ao estresse.
Além da análise do repórter, a sensibilidade ou resistência dos animais ao estresse pode ser medida por meio de ensaios de estresse fisiológico. Isso é conseguido expondo animais a ambientes estressantes que ativam vias específicas de estresse celular. Aqui, vários métodos são fornecidos para medir a sensibilidade de animais inteiros a tipos específicos de estressores.
O estresse er é aplicado a C. elegans usando o agente químico, tunicamicina, que bloqueia a glicosilação ligada a N, causando acúmulo de proteínas dobradas no ER10. Em C. elegans,o crescimento após a exposição à tnicamicina resulta em grandes perturbações na função ER, e uma redução significativa da vida útil11. Ao medir a sobrevivência dos animais em placas contendo tnicamicina, a sensibilidade ao estresse de ER dos animais pode ser quantificada. Por exemplo, animais com indução ectópica UPRER e, portanto, aumento da resistência ao estresse desdobrado de proteína no PS têm uma sobrevida aumentada sobre a exposição à tnicamicina em comparação com animais do tipo selvagem12.
O estresse oxidativo e mitocondrial é aplicado aos C. elegans expondo os animais ao agente químico, paraquat. Paraquat é um herbicida comumente usado, que causa formação de superóxido especificamente nas mitocôndrias13. Devido à localização específica de espécies de oxigênio reativo derivadas de mitocôndrias (ROS), ensaios de paraquat são frequentemente usados como um ensaio de estresse “mitocondrial”. No entanto, o superóxido é rapidamente convertido em peróxido de hidrogênio por dismutases de superóxido mitocondrial (SODs)14. O peróxido de hidrogênio pode posteriormente difundir-se para fora das mitocôndrias e causar estresse oxidativo em outros compartimentos da célula. Por isso, descrevemos ensaios de sobrevivência de paraquat como a sensibilidade de medição tanto ao estresse mitocondrial quanto ao oxidativo (outros ensaios de estresse oxidativo podem ser encontrados15).
Os ensaios de termotolerância são realizados em C. elegans colocando animais em temperaturas elevadas. As temperaturas ambientes para nematóides são de ~15-20 °C e o estresse térmico é induzido a temperaturas acima de 25 °C16,17. Os ensaios de termotolerância são geralmente realizados a temperaturas que variam de 30-37 °C, uma vez que os animais apresentam grandes defeitos celulares a esta temperatura, e os ensaios de sobrevivência são concluídos dentro de 24 horas16,18. Aqui, dois métodos alternativos são fornecidos para a realização de ensaios de termotolerância: crescimento a 34 °C e crescimento a 37 °C. Juntos, os protocolos aqui apresentados podem ser utilizados para realizar telas em larga escala quando combinados com o knock-down genético padrão usando interferência de RNA ou bibliotecas de medicamentos químicos.
O protocolo pode ser dividido em 4 procedimentos amplos: crescimento de C. elegans e preparação para imagens (seções 1 e 2), imagens de repórteres transcritores usando microscopia fluorescente (seções 3-5), medidas quantitativas de repórteres usando um citómetro de fluxo de partículas de grande porte (seção 6) e ensaios fisiológicos para medir a sensibilidade ao estresse em C. elegans (seção 7).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, são descritos métodos para interrogar respostas de estresse celular em C. elegans,usando repórteres transcritores fluorescentes e ensaios de sobrevivência do estresse fisiológico. Todos os repórteres utilizam a expressão GFP conduzida sob o promotor de um alvo transcricional a jusante dos fatores de transcrição envolvidos na montagem das respostas ao estresse celular. O uso de hsp-4p::GFP modulado por XBP-1s mediado UPRER, hsp-6p::GFP controlado por ATFS-1 mediado UPR<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.BZ. é apoiado pela bolsa de longo prazo EMBO e a Fundação Larry L. Hillblom. O R.H.S é apoiado pela bolsa 5F32AG032023-02 através do Instituto Nacional de Envelhecimento (NIA) e da Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A A.F. é apoiada pelo subsídio F32AG051355 através da NIA. H.K.G. é apoiado pela bolsa DGE1752814 através do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. é suportado por 1F31AG060660-01 através da NIA. A.D. é apoiado pela Fundação Thomas e Stacey Siebel, o Howard Hughes Medical Institute, e 4R01AG042679-04 e 5R01AG055891-02 da NIA, e 5R01ES021667-09 da NIEHS. Agradecemos a Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet e Anel Esquivel por assistência técnica significativa. Agradecemos ao laboratório morimoto e ao CGC (financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) por tensões.
Materials
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | for mitochondrial stress |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118072 | for NGM plates |
| BD Difco granulated agar | VWR | 90000-782 | for NGM plates |
| Calcium chloride dihydrate | VWR | 97061-904 | for NGM plates |
| Carbenicillin | BioPioneer | C0051-25 | for RNAi |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | for NGM plates |
| COPAS Biosorter | Union Biometrica | 350-5000-000 | equipped with a 488 nm light source. |
| COPAS Cleaning Solution | Union Biometrica | 300-5072-000 | to use with COPAS |
| COPAS Sheath Solution | Union Biometrica | 300-5070-100 | to use with COPAS |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | solvent for drugs |
| IPTG dioxane free | Denville Scientific | CI8280-4 | for RNAi |
| LB Broth Miller | Fisher Scientific | BP1426500 | for LB |
| M205FA stereoscope | Leica | 10450040 | equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-3 | for NGM plates, M9 |
| Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | for oxidative/mitochondrial stress |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | for bleach soluton |
| Potassium phosphate dibasic | VWR | EM-PX1570-2 | for NGM plates |
| Potassium phosphate monobasic | VWR | EM-PX1565-5 | for M9 |
| Revolve | ECHO | 75990-514 | equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 71289-50G | for imaging |
| Sodium Chloride | EMD Millipore | SX0420-5 | for NGM plates, M9 |
| Sodium phosphate dibasic | VWR | 71003-472 | for M9 |
| Tert-butyl hydroperoxide | Sigma-Aldrich | 458139 | for oxidative stress |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | for RNAi |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | for ER stress |
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