骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する
Summary
ここで提示されるプロトコルは、ナノニュートン分解能を有する線条筋筋筋線維の収縮特性を評価する。このプロトコルは、干渉法ベースの光学力プローブを用いたセットアップを採用しています。この設定は、高い信号対雑音比を持つデータを生成し、myofibrilsの収縮運動の評価を可能にします。
Abstract
ヒトや動物の活動には、線条筋細胞が不可欠です。単一の筋線維は、筋の中で最も小さい収縮ユニットである連続的に連結されたサルコメアで構成される筋線維で構成される。肉体機能障害は、肉体タンパク質をコードする遺伝子の変異を有する患者の筋力低下に寄与する。筋線維力学の研究は、単一の筋線維の収縮性を測定する際に損傷を受けた隣接する筋線維の潜在的な交位効果なしにアクチンとミオシン相互作用の評価を可能にする。筋線維の超構造的損傷および不整列は収縮性の障害に寄与する可能性がある。筋細動体に構造的損傷が存在する場合、分離手順中または実験中に壊れる可能性が高い。さらに、myofibrilsの研究は、サルコメアの幾何学的制約の存在下でのアクチンとミオシン相互作用の評価を提供する。例えば、筋線維の測定は、筋膜機能不全が肉体タンパク質の突然変異の主な効果であるかどうかを解明することができる。さらに、カルシウム溶液または化合物の灌流は、ミオフィブリルの小径のためにほぼ瞬時に行われる。これは、筋線維は、力の生産中に活性化および弛緩の速度を測定するために非常に適しています。本論文に記載されたプロトコルは、ナノニュートンの範囲で力を測定することができるファブリー・ペロ干渉計の原理に基づく光学力プローブを採用し、ピエゾ長モータと高速ステップ灌流システムと組み合わせる。このセットアップは、高分解能測定で筋知見力学の研究を可能にする。
Introduction
線条筋細胞は日常生活に欠かせないものです。四肢の動き、呼吸機能、心臓のポンピング運動は、筋肉細胞によって生成される力に依存する。骨格筋は、単筋線維の束を含む筋の筋線維からなる(図1A)。これらの筋線維は、連続的に連結されたサルコメアによって形成される筋線維で構成される(図1B,D)。サルコメアには薄くて厚いフィラメントが含まれています。これらは主にアクチン分子とミオシン分子の鎖から成り、それぞれ(図1B)。アクチンとミオシンの相互作用は、筋肉の力を発生させる能力を担っています.肉リン、アクチン、トロポニンTなどの肉体タンパク質をコードする遺伝子の変異を有する患者は、収縮性機能不全1による筋力低下に苦しんでいる。
筋肉の収縮の質は、生体内の筋肉全体からインビトロ運動アッセイにおけるアクチンミオシン相互作用に至るまで、組織の様々なレベルで研究することができます。過去数十年の間に、いくつかの研究グループは、個々のmyofibrils,,,,,22、3、4、5、6、7、8、9、103,4の契約性を決定するためのセットアップ9を10開発しました。5678これらの設定は、ミオフィブリルの収縮によって引き起こされるカンチレバーからのレーザー偏向(すなわち、光ビーム偏向)の変化の検出に基づいている(詳細については、Labudaら11参照)。myofibrilsの収縮機能を決定することはいくつかの制限を有するが(例えば、筋原線維の上流にある励起収縮結合過程のダイナミクスが欠けている)、このアプローチには複数の利点がある。これらには、1)サルコメアの幾何学的制約の存在下でアクチンとミオシンの相互作用を評価する能力が含まれる。2)損傷の潜在的な交交効果なしにアクチンミオシン相互作用を評価する能力、隣接する筋線維(単一の筋線維の収縮性を測定する場合、筋線維の超構造的損傷およびミスアライメントが収縮障害に寄与する可能性がある)(図1D);3)筋線維の小径(〜1μm、図2A)および膜の欠如は、サルコメアへのほぼ瞬時のカルシウム拡散を可能にする。さらに、筋細柱に構造的な損傷が存在する場合、それらは孤立中または実験中に壊れる可能性が高い。したがって、筋線維性収縮性を評価することは、筋肉収縮の基本的なメカニズムを研究し、障害のあるアクチンとミオシンの相互作用が肉体タンパク質の突然変異によって引き起こされる筋肉疾患の主な原因であるかどうかを理解するためのエレガントな方法です。
このプロトコルは、ナノニュートン分解能(すなわちOptiforce)を用いたカンチレバー力プローブを組み込んだmyofibrilsの収縮性を決定するために新しく開発されたセットアップを提示する。この力プローブは、干渉法の原理に基づいています。干渉測定は比較的堅い片持ち面の使用を可能にする。これにより、カンチレバーの偏向が少なく、ミソフィブリルの等方体収縮に近づく力を測定することが可能になる。このプローブは、人間の被験者を含む異なる筋肉生検から分離された単一の筋線維性によって生成される低受動および活動的な力を高いシグナル対雑音比で評価することを可能にする。このセットアップに組み込まれた光学カンチレバー力プローブは、ファブリ・ペロ干渉計12に基づいています。干渉計は、フェルールに取り付けられた光ファイバと金被覆のカンチレバーとの間の小さな変位を検出する(図3)。光ファイバーとカンチレバーの間のギャップは、ファブリ・ペロキャビティと呼ばれます。Myofibrilsは2つの接着剤コーティングされたガラス取り付け繊維を使用して、プローブとピエゾモーターの間に取り付けられます。ミオフィブリルによって生じる力は、干渉計データから数学的に導き出すことができる。干渉法は、2つ以上の波の重ね合わせまたは干渉に基づいています(このセットアップでは3つの光波)。波長が1,528.77~1,563.85nmのレーザー光は干渉計から放射され、光ファイバを通して送られます。プローブでは、光は光ファイバと媒体の間の界面で反射される(図3A)。2)媒体およびカンチレバーのインターフェイスで(図3B);3)カンチレバーの金属と金のコーティングの間の界面で(図3C)。インターフェイス A および B での反射は、プローブが沈み込む媒体の屈折率(n)に依存します。3つの重ね合わせ反射からなる光は、干渉計のフォトダイオードに戻ります。フォトダイオードは、光の強度を測定し、これは3つの重畳反射の干渉パターンの結果である。収縮力が筋炎を活性化または伸ばすことによって生成されると、ミオフィブリルはカンチレバーを引っ張る。この動きは、キャビティサイズ(d) を変更し、その結果、空洞に収まる波長の数を変更します。片持ち面で反射した光は相が異なり、異なる干渉パターンが生じます。フォトダイオードは、この干渉パターンの強度の変化をボルトの変化として記録します。続いて、ミオブリル力の生成は、片持ち剛性を考慮して、この変化から計算される。力プローブは、取り付け針の先端を押し、片持ちの自由手渡し端に取り付け、カンチレバーの曲げを読み出しレーザー13の波長の倍数に保ちながら計量スケールに対して製造業者によって較正される。したがって、干渉法は、ナノニュートン分解能で力の測定を可能にする、距離の小さな変化を検出する非常に敏感な方法です。この分解能により、高い信号対雑音比を持つ筋線維力の評価が可能になります。従来の干渉法では、測定範囲が干渉曲線の線形部分に制限されますが、ロックインアンプとレーザー波長の変調を使用すると、この制限を克服します14。これについては、ディスカッションのセクションで詳しく説明します。
ミオフィブリル活性緊張を測定するために、高速ステップ灌流システムを組み込んで、ミオフィブリルをカルシウム溶液に曝露した(図4A)。高速ステップ灌流システムは10 msの範囲内で起こる解決の変更を可能にする。その小さな直径のために、マイフィブリルへのカルシウム拡散はほぼ瞬時です。したがって、このシステムは、活性化および弛緩中の放出中のアクチン-ミオシン結合の速度を測定するのに特に適している。活性化率(kACT)および弛緩(kREL)は、活性化緩和曲線から決定することができる。また、濃度を高めるカルシウム溶液にミオブイブリルを曝露することにより、力とカルシウムの関係とカルシウム感受性を決定することができる。
さらに、ピエゾ長モーターは、筋形筋の速い伸縮および短縮を可能にする。これは、筋線維性の粘弾性特性(すなわち、受動的緊張)を研究する可能性を提供するとともに、筋線維の急速な短縮および再伸縮を行い、緊張再発達率(kTR)を決定する。活性および受動緊張実験の両方から得られるパラメーターは、肉体タンパク質の遺伝子変異によって変化させることができる。
このカスタム構築されたセットアップは、健康な人間、患者、およびマウス骨格筋から分離されたmyofibrilsのアクティブおよび受動的な収縮特性を測定するために使用されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載は、ヒトまたは動物骨格筋組織から分離された筋原線維の収縮機能を評価するプロトコルである。このセットアップの力の分解能は、以前にChavanらら12によって説明されています。要するに、検出繊維とカンチレバーの間に形成されたファブリ・ペロ空洞の長さのランダムな変動によって決定され、読み出しの出力(Vで表される)の出力でノイズの支配的な部分を生成し?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、AFMテレソンとネマリンミオパシーのための財団の建物の強さによって資金提供されました。著者は、この記事で言及されている製品の作成者を認めてほしいと考えています, IONOptix Inc. .
Materials
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
References
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