Isolere Myofibrils fra skjelettmuskulaturbiopsier og bestemme kontraktil funksjon med en Nano-Newton oppløsning force transduser
Summary
Presentert her er en protokoll for å vurdere kontraktile egenskapene til striated muskel myofibriller med nano-Newton oppløsning. Protokollen bruker et oppsett med en interferometribasert, optisk kraftsonde. Dette oppsettet genererer data med et høyt signal-til-støy-forhold og muliggjør vurdering av de kontraktile kinetikkene til myofibriller.
Abstract
Striated muskelceller er uunnværlig for aktiviteten til mennesker og dyr. Enkelt muskelfibre består av myofibriller, som består av serierelaterte sarkomer, de minste kontraktile enhetene i muskel. Sarcomeric dysfunksjon bidrar til muskelsvakhet hos pasienter med mutasjoner i gener koding for sarcomeric proteiner. Studien av myofibril mekanikk gjør det mulig å vurdering av actin-myosin interaksjoner uten potensielle forvirrende effekter av skadede, tilstøtende myofibriller når du måler kontraktiliteten til enkeltmuskelfibre. Ultrastrukturelle skader og feiljustering av myofibriller kan bidra til nedsatt kontraktilitet. Hvis strukturell skade er tilstede i myofibrillene, bryter de sannsynligvis under isolasjonsprosedyren eller under eksperimentet. Videre gir studier i myofibriller vurderingen av actin-myosin interaksjoner i nærvær av de geometriske begrensningene til sarkomene. For eksempel kan målinger i myofibriller belyse om myofibrillar dysfunksjon er den primære effekten av en mutasjon i et sarkomerisk protein. I tillegg er perfusjon med kalsiumløsninger eller forbindelser nesten øyeblikkelig på grunn av den lille diameteren til myofibril. Dette gjør myofibriller eminent egnet til å måle aktiveringshastigheten og avslapningen under kraftproduksjon. Protokollen som er beskrevet i dette papiret, bruker en optisk kraftsonde basert på prinsippet om et Fabry-Pérot interferometer som er i stand til å måle krefter i nano-Newton-serien, kombinert med en piezo lengde motor og et raskt perfusjonssystem. Dette oppsettet gjør det mulig å studere myofibril mekanikk med høyoppløselige kraftmålinger.
Introduction
Striated muskelceller er uunnværlig for daglige aktiviteter. Lembevegelse, åndedrettsfunksjon og hjertets pumpebevegelse er avhengig av kraften som genereres av muskelceller. Skjelettmuskulatur består av muskel fascicles som inneholder bunter av enkelt muskelfibre (Figur 1A). Disse muskelfibrene består av myofibriller, som er dannet av serielt tilknyttede sarkomer (figur 1B, D). Sarkomene inneholder tynne og tykke filamenter. Disse består hovedsakelig av kjeder av actin og myosin molekyler, henholdsvis (Figur 1B). Actin-myosin interaksjoner er ansvarlig for kraftgenererende kapasitet av muskel. Pasienter med mutasjoner i gener koding for sarcomeric proteiner, som nebulin, actin, og troponin T, lider av muskelsvakhet på grunn av kontraktildysfunksjon 1.
Kvaliteten på muskelkontraktilitet kan studeres på ulike nivåer av organisasjon, alt fra in vivo hele muskler til actin-myosin interaksjoner i in vitro motilitetsanalyser. I løpet av de siste tiårene har flere forskningsgrupper utviklet oppsett for å bestemme kontraktiliteten til individuelle myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,10. Disse oppsettene er basert på påvisning av endringer i laserdebøyning fra en cantilever (det vil si optisk stråledebøyning) forårsaket av sammentrekning av myofibril (for detaljer, se Labuda et al.11). Selv om det å bestemme den kontraktile funksjonen til myofibriller har noen begrensninger (f.eks. dynamikken i excitation-sammentrekningskoblingsprosessene som er oppstrøms av myofibrilene mangler), er det flere fordeler med denne tilnærmingen. Disse inkluderer: 1) evnen til å vurdere actin-myosin interaksjoner i nærvær av geometriske begrensninger av sarcomeres; 2) evnen til å vurdere actin-myosin interaksjoner uten potensielle forvirrende effekter av skadede, tilstøtende myofibriller (når du måler kontraktiliteten til enkelt muskelfibre ultrastrukturell skade og feiljustering av myofibrils kan bidra til nedsatt kontraktilitet) (Figur 1D); 3) den lille diameteren av myofibriller (~ 1 μm, figur 2A) og mangel på membraner tillater nesten øyeblikkelig kalsiumdiffusjon i sarkomene. Videre, hvis strukturell skade er tilstede i myofibrils, bryter de sannsynligvis under isolasjonen eller under eksperimentet. Derfor er vurdering av myofibril kontraktilitet en elegant metode for å studere de grunnleggende mekanismene for muskelsammentrekning og for å forstå om forstyrret actin-myosin interaksjoner er den primære årsaken til muskelsykdom forårsaket av mutasjoner i sarkomeriske proteiner.
Denne protokollen presenterer et nyutviklet oppsett for å bestemme kontraktiliteten til myofibriller som omfatter en cantilever force probe med nano-Newton-oppløsning (det vil si Optiforce). Denne kraftsonden er basert på prinsippet om interferometri. Interferometri muliggjør bruk av relativt stive cantilevers. Dette gjør det mulig å måle kraft med liten nedbøyning av cantilever, nærmer isometriske sammentrekninger av myofibril. Sonden gjør det mulig å vurdering av lave passive og aktive krefter som produseres av en enkelt myofibril isolert fra forskjellige muskelbiopsier, inkludert de fra menneskelige, med et høyt signal-til-støy-forhold. Den optiske cantilever force probe innlemmet i dette oppsettet er basert på en Fabry-Pérot interferometer12. Interferometeret oppdager små forskyvninger mellom en optisk fiber og en gullbelagt cantilever montert på en ildsjød (figur 3). Gapet mellom den optiske fiberen og cantilever kalles Fabry-Pérot hulrom. Myofibrils er montert mellom sonden og piezo motor ved hjelp av to limbelagte glass monteringsfibre. Kraften produsert av myofibril kan matematisk avledet fra interferometerdataene. Interferometri er basert på superposisjon eller interferens av to eller flere bølger (i dette oppsettet tre lysbølger). Laserlys med bølgelengde mellom 1,528.77-1,563.85 nm slippes ut fra interferometeret og sendes gjennom den optiske fiberen. I sonden reflekteres lyset 1) ved grensesnittet mellom den optiske fiberen og mediet (figur 3A); 2) på grensesnittet til mediet og cantilever (Figur 3B); og 3) i grensesnittet mellom metall og gull belegg av cantilever (Figur 3C). Refleksjonen ved grensesnitt A og B er avhengig av brytningsindeksen (n) av mediet der sonden er nedsenket. Lyset, bestående av de tre overliggende refleksjonene, går tilbake til en fotodiode i interferometeret. Fotodioden måler intensiteten av lyset, som er et resultat av interferensmønsteret til de tre overliggende refleksjonene. Når kontraktil kraft genereres ved å aktivere eller strekke en myofibril, trekker myofibril på cantilever. Denne bevegelsen endrer hulromsstørrelsen (d) og dermed antall bølgelengder som passer i hulrommet. Lyset som reflekteres på cantilever vil ha en annen fase, noe som resulterer i et annet interferensmønster. Fotodioden registrerer denne endringen av interferensmønsterintensitet som en endring i Volt. Deretter beregnes myofibril kraftgenerering fra denne endringen, med hensyn til cantilever stivheten. Kraftsonden kalibreres av produsenten ved å skyve spissen av monteringsnålen, festet til den frie utdelingsenden av kantileveren, mot en veieskala samtidig som bøyingen av kantileveren tilsvarer et multiplum av bølgelengden til avlesningslaseren13. Dermed er interferometri en svært følsom metode for å oppdage små endringer i avstand, noe som åpner for måling av krefter med nano-Newton-oppløsning. Denne oppløsningen muliggjør vurdering av myofibrillar kraftproduksjon med et høyt signal-til-støy-forhold. Mens tradisjonell interferometry begrenser omfanget av målinger til den lineære delen av interferenskurven, overvinner bruk av en innlåst forsterker og modulering av laserbølgelengden dennebegrensningen 14. Dette forklares nærmere i diskusjonsdelen.
For å måle myofibril aktiv spenning ble et raskt skritts perfusjonssystem innlemmet for å utsette myofibril for kalsiumløsninger (figur 4A). Det raske perfusjonssystemet gjør det mulig å finne løsningsendringer innen 10 ms. På grunn av deres lille diameter er kalsiumdiffusjon i myofibrillene nesten øyeblikkelig. Derfor er dette systemet spesielt egnet for å måle frekvensen av actin-myosin binding under aktivering og frigjøring under avslapning. Aktiveringshastigheten (kACT)og avslapning (kREL)kan bestemmes av aktiverings-avslapningskurvene. Også ved å utsette myofibrillene for kalsiumløsninger av økende konsentrasjon, kan kraftkalsiumforholdet og kalsiumfølsomheten bestemmes.
Videre muliggjør en piezo lengde motor rask strekking og forkortelse av myofibril. Dette gir mulighet til å studere de viskoelastiske egenskapene (det vil si passiv spenning) av myofibril, samt utføre en rask forkortelse og restretch av myofifi for å bestemme frekvensen av spenningsutvikling (kTR). Parametrene hentet fra både aktive og passive spenningseksperimenter kan endres av genmutasjoner i et sarkomerisk protein.
Dette spesialbygde oppsettet ble brukt til å måle de aktive og passive kontraktile egenskapene til myofibriller isolert fra sunn menneskelig, pasient og mus skjelettmuskulatur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet er en protokoll for å vurdere kontraktil funksjon av myofibriller isolert fra menneskelig eller dyr skjelettmuskulatur vev. Kraftoppløsningen til dette oppsettet har tidligere blitt beskrevet av Chavan et al.12. Kort sagt, det bestemmes av de tilfeldige svingningene i lengden av Fabry-Pérot-hulrommet dannet mellom deteksjonsfiberen og cantilever, som produserer den dominerende delen av støyen ved utgangen av avlesningen (uttrykt i V) som multiplisert med avbøyningsfølsomheten (uttr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble finansiert av AFM-Telethon og A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies. Forfatterne ønsker å anerkjenne skaperen av produktene nevnt i denne artikkelen, IONOptix Inc.
Materials
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
References
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).
- Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
- Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
- Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
- de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
- Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
- Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
- Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
- Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
- Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
- van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
- Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
- Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
- Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
- Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
- Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
- Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).
