मूत्र बी-1ए कोशिकाओं पर CXCR4 का रेट्रोवायरल अतिअभिव्यक्ति और बोन मैरो और आईजीएम उत्पादन के लिए लक्षित बी-1ए सेल माइग्रेशन के लिए दत्तक हस्तांतरण
Summary
यहां हम वीवो बी-1ए सेल माइग्रेशन और स्थानीयकरण में जांच करने के लिए रेट्रोवायरल अतिअभिव्यक्ति और मूत्र बी-1ए कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल को विविध डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक परखों के लिए बढ़ाया जा सकता है जिसमें दाता बी-1ए सेल स्थानीयकरण या दाता सेल-व्युत्पन्न गुप्त कारकों के विश्लेषण के बाद दत्तक हस्तांतरण शामिल हैं।
Abstract
चूंकि सेल फ़ंक्शन सेलुलर माइक्रोएनवायरमेंट में आला-विशिष्ट कारकों से प्रभावित होता है, इसलिए सेल स्थानीयकरण और माइग्रेशन को विच्छेदन करने के तरीके सेल फ़ंक्शन पर आगे की जानकारी प्रदान कर सकते हैं। बी-1ए कोशिकाएं चूहों में एक अद्वितीय बी सेल सबसेट हैं जो स्वास्थ्य और रोग के दौरान उत्पन्न होने वाले ऑक्सीकरण-विशिष्ट एपिटोप के खिलाफ सुरक्षात्मक प्राकृतिक आईजीएम एंटीबॉडी का उत्पादन करती हैं। बी-1ए सेल आईजीएम उत्पादन बी-1 ए सेल स्थान के आधार पर अलग है, और इसलिए यह उच्च एंटीबॉडी उत्पादन के सहायक निकस के लिए बी-1ए स्थानीयकरण को लक्षित करने के लिए एक चिकित्सीय दृष्टिकोण से उपयोगी हो जाता है। यहां हम सी-एक्स-सी आकृति केमोकिन रिसेप्टर 4 (CXCR4) के रेट्रोवायरल-मध्यस्थता अतिअभिव्यक्ति द्वारा बोन मैरो में बी-1ए सेल माइग्रेशन को लक्षित करने की विधि का वर्णन करते हैं। प्राथमिक मूत्र बी कोशिकाओं में जीन प्रेरण चुनौतीपूर्ण हो सकता है और आम तौर पर तकनीक के आधार पर 10-20% की कम ट्रांसफेक्शन क्षमता पैदा करता है। यहां हम प्रदर्शित करते हैं कि प्राथमिक मूत्र बी-1ए कोशिकाओं के रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूक्शन के परिणामस्वरूप 30-40% ट्रांसड्यूक्शन दक्षता होती है। यह विधि बी सेल-कमी प्राप्तकर्ता चूहों में ट्रांसड्यूड बी-1ए कोशिकाओं के दत्तक सेल हस्तांतरण का उपयोग करती है ताकि दाता बी-1ए सेल माइग्रेशन और स्थानीयकरण की कल्पना की जा सके। इस प्रोटोकॉल को अन्य रेट्रोवायरल निर्माणों के लिए संशोधित किया जा सकता है और इसका उपयोग विभिन्न कार्यात्मक परखों के बाद दत्तक हस्तांतरण में किया जा सकता है, जिसमें दाता सेल या मेजबान सेल फेनोटाइप और फ़ंक्शन का विश्लेषण, या बी-1ए सेल हस्तांतरण के बाद स्रावित घुलनशील कारकों का विश्लेषण शामिल है। सीडी 45.1 और सीडी45.2 एलोटाइप द्वारा अलग-अलग दाता और प्राप्तकर्ता चूहों का उपयोग और रेट्रोवायरल प्लाज्मिड के भीतर एक जीएफपी रिपोर्टर की उपस्थिति भी एंडोजेनस बी सेल आबादी वाले अन्य, प्रतिरक्षा-पर्याप्त माउस मॉडल में दाता कोशिकाओं का पता लगाने में सक्षम हो सकती है।
Introduction
हाल के अध्ययनों ने काफी प्रतिरक्षा कोशिका का प्रदर्शन किया है, और विशेष रूप से बी सेल, फेनोटाइपिक और कार्यात्मक विषमता सेल स्थानीयकरण1,,2,,3,,4,,5के आधार पर। बी-1ए कोशिकाएं सुरक्षात्मक आईजीएम एंटीबॉडी का उत्पादन करने की विषम क्षमता वाली ऐसी आबादी हैं; बोन मैरो बी-1ए कोशिकाएं आईजीएम को संविलियन रूप से स्रावित करती हैं और प्लाज्मा आईजीएम टिटर6में महत्वपूर्ण योगदान देती हैं, जबकि पेरिटोनियल बी-1ए कोशिकाओं में होमोस्टोसिस में निम्न स्तर का आईजीएम स्राव होता है और इसके बजाय सहज टोल-जैसे रिसेप्टर (टीएलआर) या साइटोकिने-मध्यस्थता संकेत के माध्यम से सक्रिय किया जा सकता है। माइग्रेट, और स्राव IgM7,8,9,10. बी-1ए सेल आईजीएम एंटीबॉडी ऑक्सीकरण-विशिष्ट एपिटोप (ओएसई) को पहचानते हैं जो रोगजनकों, अपोप्टिक कोशिकाओं और ऑक्सीकृत एलडीएल पर मौजूद हैं, और ओएसई के लिए आईजीएम बाध्यकारी एथेरोस्क्लेरोसिस11जैसी बीमारियों में भड़काऊ डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग को रोक सकता है। इसलिए, अस्थि मज्जा जैसी साइटों के लिए पेरिटोनियल बी-1ए सेल माइग्रेशन बढ़ाने के माध्यम से आईजीएम उत्पादन बढ़ाने की रणनीतियां चिकित्सकीय रूप से उपयोगी हो सकती हैं। हालांकि, ऐसी रणनीतियों को लक्षित और सेल-प्रकार विशिष्ट होना महत्वपूर्ण है, क्योंकि ऑफ-टारगेट प्रभाव प्रतिरक्षा कार्य या स्वास्थ्य को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं।
यहां हम प्राथमिक मूत्र बी-1 ए कोशिकाओं में सीएक्ससीआर 4 के लक्षित और दीर्घकालिक अतिअभिव्यक्ति के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं और सेल माइग्रेशन और कार्यात्मक आईजीएम एंटीबॉडी उत्पादन(चित्रा 1)की कल्पना करने के लिए बाद में दत्तक हस्तांतरण करते हैं। प्राथमिक बी कोशिकाओं के आनुवंशिक हेरफेर बदल सेल लाइनों के ट्रांसफेक्शन की तुलना में कम ट्रांसफेक्शन क्षमता से सीमित है। हालांकि, के रूप में बदल सेल लाइनों काफी प्राथमिक कोशिकाओं12,,13से विचलित कर सकते हैं, प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग के परिणाम है कि अधिक बारीकी से सामांय शरीर विज्ञान के लिए संरेखित प्रदान करने की संभावना है । प्राथमिक मूत्र बी कोशिकाओं में जीन हस्तांतरण के लिए कई तकनीकों का वर्णन किया गया है, जिनमें रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूक्शन, एडेनोवायरल ट्रांसड्यूक्शन, लिपोफेक्शन, या इलेक्ट्रोपोराशन-आधारित ट्रांसफेक्शन शामिल हैं, जिनमें दक्षता, क्षणिकता और कोशिका स्वास्थ्य13,,14,,15पर प्रभाव के स्तर अलग-अलग होते हैं। निम्नलिखित विधि ने रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूक्शन का उपयोग किया क्योंकि इसमें सेल व्यवहार्यता को कम से कम प्रभावित करते हुए और 30% की पर्याप्त जीन हस्तांतरण दक्षता मिली। CXCR4-व्यक्त रेट्रोवायरस पहले वर्णित रेट्रोवायरल निर्माण मूत्र स्टेम सेल वायरस-आंतरिक राइबोसोमल प्रवेश साइट-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (MSCV-IRES-GFP) का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था; MigR1)16,जिसमें माउस CXCR4 जीन उप क्लोन4था । मिगआर1 (नियंत्रण (सीटीएल) जीएफपी) और सीएक्ससीआर4-जीएफपी रेट्रोवायरल कण कैल्शियम फॉस्फेट ट्रांसफेक्शन का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे जैसा कि पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल4,,14में वर्णित है।
सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूड बी-1ए कोशिकाओं को नसों में लिम्फोसाइट-कमी वालेRag1-/-चूहों में स्थानांतरित कर दिया गया । दाता और प्राप्तकर्ता चूहों दोनों ने अतिरिक्त रूप से एपोलिपोप्रोटीन ई (एपीओई) जीन के नॉकआउट को शामिल किया, जिसके परिणामस्वरूप ओएसई संचय और एथेरोस्क्लेरोसिस में वृद्धि होती है, जिससे वीवो बी-1 सेल सक्रियण और आईजीएम उत्पादन में एक मॉडल प्रदान होता है। इसके अलावा, दाता और प्राप्तकर्ता चूहों CD45 allotype में मतभेद; दाता बी-1 कोशिकाएं CD45.1 +ApoE-/-चूहों से आई थीं और उन्हेंRag1-/-CD45.2 + ApoE-/-प्राप्तकर्ताओं में स्थानांतरित कर दिया गया था ।-/- इसने प्राप्तकर्ता CD45.2 बी कोशिकाओं से दाता CD45.1 के अंतर की अनुमति दी, जिसमें प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के दौरान बी सेल मार्कर के लिए अतिरिक्त दाग की आवश्यकता के बिना स्थानांतरण किया गया था। यहां प्रदान किए गए परिणाम ों से पता चलता है कि बी-1ए कोशिकाओं पर लक्षित CXCR4 अतिअभिव्यक्ति बी-1ए कोशिकाओं की बढ़ी हुई क्षमता के साथ बोन मैरो में स्थानांतरित करने के लिए, जो बढ़ी हुई प्लाज्मा एंटी-ओएसई आईजीएम के साथ संबद्ध है । हम इसके अतिरिक्त नकारात्मक चयन के माध्यम से पेरिटोनियल बी-1 कोशिकाओं के संवर्धन के लिए एक विधि प्रदान करते हैं और कुशल ट्रांसड्यूक्शन के लिए बी-1 सेल सक्रियण की आवश्यकता को प्रदर्शित करते हैं। बी-1ए सेल माइग्रेशन, फेनोटाइप या फ़ंक्शन पर प्रोटीन ओवरएक्सप्रेशन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस विधि को अन्य रेट्रोवायरल निर्माणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, CD45.1 बनाम CD45.2 एलोटाइप भेद का उपयोग सैद्धांतिक रूप से एंडोजेनस बी कोशिकाओं वाले अन्य प्रतिरक्षा-पर्याप्त मूत्र मॉडल में हस्तांतरण की अनुमति दे सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रदान की गई विधि वीवो दत्तक हस्तांतरण में स्थिर और अपेक्षाकृत कुशल प्राथमिक बी-1ए सेल जीन डिलीवरी, और इंजेक्शन कोशिकाओं की पहचान और स्थानीयकरण को सक्षम बनाती है। कोशिकाओं को 17 सप्ताह के बाद सेल ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, P01 HL01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara), और R01GM100776 (T.P. शराबी) के प्रोजेक्ट 3 द्वारा समर्थित किया गया था । A. Upadhye अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप 16PRE30300002 और 5T32AI007496-20 द्वारा समर्थित था । हम जोऐन लैनिगन, माइक सोल्गा और क्लाउड चबाना वर्जीनिया विश्वविद्यालय के फ्लो साइटोमेट्री कोर से उनकी उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
- Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
- Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
- Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
- Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
- Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
- Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
- Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
- Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
- Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
- Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
- Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
- DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
- Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
- Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
- Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
- Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
- Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).
