Ретровирусная переэкспрессия CXCR4 на клетках Murine B-1a и приемная передача для целевой миграции клеток B-1a к костному мозгу и производству IgM
Summary
Здесь мы описываем метод ретровирусной переэкспрессии и приемной передачи клеток murine B-1a для изучения миграции и локализации клеток vivo B-1a. Этот протокол может быть расширен для различных вниз по течению функциональных анализов, включая количественную оценку донорской B-1a локализации клеток или анализ донорских клеток, полученных секретных факторов после принятия передачи.
Abstract
Поскольку функция клеток зависит от нишевых факторов в клеточной микросреде, методы вскрытия локализации клеток и миграции могут обеспечить дальнейшее понимание функции клеток. Клетки B-1a являются уникальным подмножеством В-клеток у мышей, которые производят защитные природные антитела IgM против окислительных эпитопов, которые возникают во время здоровья и болезней. B-1a ячейки IgM производства отличается в зависимости от B-1a расположение клеток, и поэтому она становится полезной с терапевтической точки зрения целевой B-1a локализации ниш, поддерживающих высокий выработку антител. Здесь мы описываем метод целевой b-1a миграции клеток в костный мозг ретровирусно-опосредованной переэкспрессии C-X-C мотив хемокин рецептор 4 (CXCR4). Индукция гена в первичных клетках murine B может быть сложной задачей и, как правило, дает низкую эффективность трансфекции 10-20% в зависимости от техники. Здесь мы демонстрируем, что ретровирная трансдукция первичных клеток murine B-1a приводит к 30-40% эффективности трансдукции. Этот метод использует приемную передачу клеток трансиндуцированных клеток B-1a в в клетки-дефицитных мышей-реципиента, так что донор B-1a клеточной миграции и локализации могут быть визуализированы. Этот протокол может быть изменен для других ретровирусных конструкций и может быть использован в различных функциональных анализах после приемной передачи, включая анализ фенотипа и функции клеток-доноров, или анализ растворимых факторов, выделяемых после переноса клеток B-1a. Использование различных доноров и мышей-реципиентов, дифференцированных по аллотипу CD45.1 и CD45.2, а также наличие репортера GFP в ретровирусной плазмиде может также способствовать обнаружению донорских клеток в других, иммунодостаточном мышах, содержащих эндогенные популяции клеток B.
Introduction
Недавние исследования продемонстрировали значительную иммунную клетку, и в частности В-клетки, фенотипические и функциональные неоднородности в зависимости от локализации клеток1,2,,3,,4,5. Клетки B-1a являются одной из таких популяций с неоднородной способностью производить защитные антитела IgM; клетки костного мозга B-1a выделяют IgM constitutively и вносят значительный вклад в плазмеigTters9,6,в то время как перитонеальные клетки B-1a имеют низкоуровневую секрецию IgM при гомеостазе и7вместо этого могут быть активированы через врожденный платный рецептор (TLR) или цитокин-опосредованное сигнализацию для быстрого пролиферирования, мигрировать, и выделять 70,890, B-1a клетки IgM антитела признают окисления конкретных эпитопов (OSE), которые присутствуют на патогенных микроорганизмов, апоптотические клетки, и окисленных ЛПНП, и IgM связывания с OSE может предотвратить воспалительные вниз по течению сигнализации при таких заболеваниях, как атеросклероз11. Таким образом, стратегии по увеличению производства IgM за счет увеличения миграции клеток Перитонеала B-1a к местам, как костный мозг может быть терапевтически полезным. Тем не менее, важно, чтобы такие стратегии были целенаправленными и клеточными, так как внецелевые эффекты могут негативно сказаться на иммунной функции или здоровье.
Здесь мы описываем метод целевого и долгосрочного перевыражения CXCR4 в первичных клетках murine B-1a и последующую приемную передачу для визуализации миграции клеток и функционального производства антител IgM (Рисунок 1). Генетическое манипулирование первичными В-клетками ограничено низкой трансфекционной эффективностью по сравнению с трансфекцией преобразованных клеточных линий. Однако, как преобразованные клеточные линии могут значительно отклоняться от первичных клеток12,13, использование первичных клеток, вероятно, обеспечит результаты, которые более тесно выровнять нормальной физиологии. Несколько методов были описаны для передачи генов в первичных клеток murine B, в том числе ретровирусной трансдукции, аденовирусной трансдукции, липофектации, или электропорации на основе трансфекции, которые имеют различные уровни эффективности, трансиенции и воздействия на здоровье клеток13,14,15. Следующий метод использовал ретровиральные трансдукции, как это дало адекватную эффективность передачи генов в размере 30%, в то время как минимально влияющих жизнеспособности клеток. CXCR4-выражения ретровирус был создан с помощью ранее описанной ретровирусной конструкции муриновых стволовых клеток вируса-внутреннего рибосомного входа сайта-зеленый флуоресцентный белок (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, в котором ген мыши CXCR4 был субклонирован4. MigR1 (контроль (Ctl)-GFP) и ретровирусные частицы CXCR4-GFP были созданы с использованием трансфекции фосфатов кальция, как описано в ранее опубликованных протоколах4,14.
Успешно трансиндуцированные клетки B-1a затем внутривенно передавались в лимфоциты-дефицитные Rag1-/- мышей. И донорские, и реципиентные мыши дополнительно содержали нокаут гена аполипопротеина E (ApoE), что приводит к увеличению накопления OSE и атеросклерозу, обеспечивая тем самым модель для активации клеток in vivo B-1 и производства IgM. Кроме того, донорские и реципиентные мыши отличались аллотипом CD45; донорские клетки B-1 пришли из CD45.1 “ApoE-/- мышей и были переведены в Rag1-/- CD45.2″ ApoE-/- реципиентов. Это позволило дифференциацию донора CD45.1 от реципиента CD45.2 B клеток после передачи без необходимости дополнительно пятно для Маркеров В клеток во время анализа цитометрии потока. Полученные здесь результаты показывают, что целевая переэкспрессия CXCR4 на клетках B-1a ассоциируется с повышенной способностью клеток B-1a мигрировать в костный мозг, который ассоциируется с повышенной плазменной анти-OSE IgM. Мы дополнительно предоставляем метод для обогащения перитонеальных в-1 клеток через отрицательный отбор и демонстрируем необходимость активации клеток B-1 для эффективной трансдукции. Этот метод может быть адаптирован для других ретровирусных конструкций для изучения влияния переэкспрессии белка на миграцию клеток B-1a, фенотип, или функции. Кроме того, использование CD45.1 против CD45.2 аллотип различия теоретически может позволить переход в другие иммунологические модели, содержащие эндогенные В-клетки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предоставляемый здесь метод обеспечивает стабильную и относительно эффективную доставку первичного гена клеток B-1a, приемную передачу vivo, идентификацию и локализацию инъекционных клеток. Клетки были в состоянии быть обнаружены 17 недель после клеточного перевода и сохранили повышенн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Проект 3 P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) и R01GM100776 (Т.П. Бендер). A. Upadhye была поддержана Американской ассоциацией сердца Предварительная докторская стипендия 16PRE30300002 и 5T32AI007496-20. Мы благодарим Джоан Ланниган, Майка Солгу и Клода Чу из Университета Вирджинии Flow Cytometry Core за отличную техническую помощь.
Materials
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
- Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
- Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
- Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
- Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
- Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
- Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
- Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
- Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
- Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
- Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
- Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
- DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
- Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
- Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
- Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
- Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
- Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).
