マウスB-1a細胞におけるCXCR4のレトロウイルス過剰発現と骨髄およびIgM産生への標的B-1a細胞の移行のための養子転移
Summary
ここでは、生体内B-1a細胞の移行および局在化を調べるマウスB-1a細胞のレトロウイルス過剰発現および導入導入の方法について説明する。このプロトコルは、ドナーB-1a細胞の局在化の定量化や、導入後のドナー細胞由来分泌因子の分析を含む、多様な下流機能アッセイに拡張することができる。
Abstract
細胞機能は細胞微小環境におけるニッチ特有の因子の影響を受けるため、細胞の局在化および移行を解剖する方法は、細胞機能に関するさらなる洞察を提供することができる。B-1a細胞は、健康および疾患の間に生じる酸化特異的エピトープに対して保護的な天然IgM抗体を産生するマウスにおけるユニークなB細胞サブセットである。B-1a細胞IgMの産生はB-1a細胞の位置によって異なるため、治療的観点からB-1a局在化を標的とする標的、高い抗体産生を支持するニッチまで有用となる。ここでは、C-X-Cモチーフケモカイン受容体4(CXCR4)のレトロウイルス媒介過剰発現により骨髄へのB-1a細胞移行を標的とする方法について説明する。原発性マウスB細胞における遺伝子誘導は困難であり、通常は技術に応じて10〜20%の低いトランスフェクション効率をもたらす。ここでは、原生マウスB-1a細胞のレトロウイルス伝達が30〜40%のトランスダクション効率をもたらすことを実証する。この方法は、ドナーB-1a細胞の移行および局在化を可視化できるように、B細胞欠損レシピエントマウスへのB細胞欠損型マウスへの導入されたB-1a細胞の導入細胞移管を利用する。このプロトコルは、他のレトロウイルス構造のために変更することができ、ドナー細胞または宿主細胞表現型および機能の分析、またはポストB-1a細胞転写の可分泌因子の分析を含む、養子導入後の多様な機能アッセイで使用することができる。CD45.1およびCD45.2の同種別によって分化された別個のドナーおよびレシピエントマウスの使用およびレトロウイルスプラスミド内のGFPレポーターの存在はまた、内因性B細胞集団を含む他の免疫不十分なマウスモデルにおけるドナー細胞の検出を可能にすることができる。
Introduction
最近の研究では、かなりの免疫細胞、特にB細胞、細胞の,局在1、2、3、4、52,3に依存1するフェノティピックおよび機能的異質性が実証されている。4,5B-1a細胞は、保護IgM抗体を産生する異種能力を有するそのような集団の1つである。骨髄B-1a細胞は、IgMを構成的に分泌し、血漿IgM力価6に大きく寄与する一方、腹膜B-1a細胞は恒常性で低レベルのIgM分泌を有し、代わりに自然なToll-like受容体(TLR)またはサイトカイン媒介シグナル伝達を介して活性化7,8,9,することができる。B-1a細胞IgM抗体は、病原体、アポトーシス細胞、および酸化LDLに存在する酸化特異的エピトープ(OSE)を認識し、OSEにIgM結合すると、アテローム性動脈硬化症などの疾患における炎症性下流シグナル伝達を防ぐことができる。したがって、骨髄のような部位への腹膜B-1a細胞遊泳を介してIgM産生を増加させる戦略は治療的に有用であり得る。しかし、オフターゲット効果が免疫機能や健康に悪影響を及ぼす可能性があるため、このような戦略を標的とし、細胞型特異的であることが重要です。
ここでは、一次マウスB-1a細胞におけるCXCR4の標的化および長期過剰発現の方法と、その後の細胞移動および機能IgM抗体産生を可視化するためのその後の導入導入について説明する(図1)。原発性B細胞の遺伝子操作は、トランスフェクション細胞株のトランスフェクションに比べてトランスフェクション効率が低い場合に制限されます。しかし、形質転換細胞株が12,13の原細胞から著しく逸脱する可能性があるため、13初等細胞の使用は、通常の生理学により密接に一致する結果をもたらす可能性が高い。レトロウイルス伝達、アデノウイルス伝達、リポフェクション、またはエレクトロポレーションベースのトランスフェクションを含む、一次マウスB細胞における遺伝子導入に関するいくつかの技術が記載,14,されているが、これは、効率、一過性、および細胞の健康への影響のレベルが異なる。以下の方法は、細胞生存率に影響を及ぼしながら>30%の十分な遺伝子導入効率を生み出すため、レトロウイルス伝達を利用した。CXCR4発現レトロウイルスは、前述のレトロウイルス構築マウス幹細胞ウイルス-内部リボソームエントリー部位-緑色蛍光タンパク質(MSCV-IRES-GFP;MigR1)16,マウスCXCR4遺伝子がクローン4をサブクローニングした.MigR1 (制御(Ctl)-GFP) およびCXCR4-GFPレトロウイルス粒子は、前に公開されたプロトコル4,,14に記載されているようにリン酸カルシウムトランスフェクションを使用して生成した。
正常にB-1a細胞を導入し、次いで静脈内にリンパ球欠損Rag1-/-マウスに移した。ドナーマウスとレシピエントマウスの両方に、さらにアポリポプロテインE(ApoE)遺伝子のノックアウトが含まれ、OSE蓄積およびアテローム性動脈硬化が増加し、それによってインビボB-1細胞活性化およびIgM産生のモデルを提供する。さらに、ドナーマウスとレシピエントマウスはCD45同種で異なった。ドナーB-1細胞はCD45.1+ApoE-/-マウスから来て、Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/-レシピエントに移された。-/- -/-これにより、フローサイトメトリー分析中にB細胞マーカーの染色を追加する必要なしに、レシピエントCD45.2B細胞からのドナーCD45.1の転写後の分化が可能となった。ここで示した結果は、B-1a細胞上の標的CXCR4過剰発現が、B-1a細胞が骨髄に移行する能力の増加と関連していることを示し、これは血漿抗OSE IgMの増加と関連している。さらに、負選択による腹膜B-1細胞の濃縮方法を提供し、効率的なトランスダクションのためのB-1細胞活性化の要件を実証する。この方法は、B-1a細胞遊マイグレーション、表現型、または機能に対するタンパク質過剰発現の影響を研究するために、他のレトロウイルス構築物に適応することができる。さらに、CD45.1対CD45.2の同種区別の使用は、理論的には内因性B細胞を含む他の免疫不足のマウスモデルへの伝達を可能にする可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提供される方法は、安定かつ比較的効率的な一次B-1a細胞遺伝子の送達、生体内導入導入、および注入された細胞の同定および局在化を可能にする。細胞は17週後の細胞転移を検出することができ、CXCR4発現の増加を保持した。レトロウイルス媒介性送達は、私たちの手の細胞生存率への影響を最小限に抑えて、プライマリマウスB-1a細胞の30〜40%のトランスダクション効率を生み出した(<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、1R01 HL107490、1R01 HL136098、P01 HL055798のプロジェクト3、P01 HL136275-01(C.A.マクナマラ)、R01GM100776(T.P.ベンダー)によってサポートされました。A. Upadhyeは、米国心臓協会の博士研究員16PRE30300002および5T32AI007496-20によって支えられた。バージニア大学フローサイトメトリーコアのジョアン・ラニガン、マイク・ソルガ、クロード・チューの優れた技術支援に感謝します。
Materials
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
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