뮤린 B-1a 세포에 CXCR4의 레트로 바이러스 과발현 및 골수와 IgM 생산에 표적 B-1a 세포 이동을 위한 채택 전송
Summary
여기서 우리는 생체 내 B-1a 세포 이동 및 국소화를 검사하기 위해 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 과발현 및 입양 전달방법을 설명한다. 본 프로토콜은 기증자 B-1a 세포 국소화의 정량화 또는 기증자 세포 유래 분비 인자의 분석 후 입양 전달을 포함하는 다양한 다운스트림 기능 성 분석을 위해 확장될 수 있다.
Abstract
세포 기능이 세포 미세 환경의 틈새 특이적 요인에 의해 영향을 받므로 세포 국소화 및 이동을 해부하는 방법은 세포 기능에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있습니다. B-1a 세포는 건강과 질병 도중 발생하는 산화 특이적 에피토프에 대하여 보호천연 IgM 항체를 생성하는 마우스에 있는 유일한 B 세포 서브세트입니다. B-1a 세포 IgM 생산은 B-1a 세포 위치에 따라 다르며, 따라서 높은 항체 생산을 지지하는 틈새 시장까지 B-1a 국소화를 표적으로 하는 치료적 관점에서 유용하게 된다. 여기서 우리는 C-X-C 모티프 케모카인 수용체 4(CXCR4)의 레트로바이러스 매개 과발현에 의해 골수로B-1a 세포 이동을 표적으로 하는 방법을 설명한다. 1 차적인 murine B 세포에 있는 유전자 유도는 도전적일 수 있고 전형적으로 기술에 따라서 10-20%의 낮은 형혈 성 효율성을 산출합니다. 여기에서 우리는 1 차적인 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 성 환전이 30-40% 형질전환 효율을 초래한다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 기증자 B-1a 세포 이동 및 국소화가 가시화될 수 있도록 B 세포 결핍 수용자 마우스로 변환된 B-1a 세포의 입양 세포 전달을 이용합니다. 이 프로토콜은 다른 레트로바이러스 구성을 위해 변형될 수 있으며, 기증자 세포 또는 숙주 세포 표현형 및 기능의 분석, 또는 B-1a 세포 전달 후 분비된 수용성 인자의 분석을 포함하여 다양한 기능성 분석사에서 사용될 수 있다. CD45.1 및 CD45.2 동형및 레트로바이러스 플라스미드 내에 GFP 리포터의 존재에 의해 분화된 뚜렷한 공여자 및 수용인자 마우스의 사용은 또한 내인성 B 세포 집단을 포함하는 다른, 면역 이충분한 마우스 모델에서 공여자 세포의 검출을 가능하게 할 수 있었다.
Introduction
최근 연구는 상당한 면역 세포, 특히 B 세포, 특히 세포 국소화에 따라 자형질 및 기능적 이질성을입증했다1,2,,3,,4,5.5 B-1a 세포는 보호 IgM 항체를 생성하는 이기종 용량을 가진 하나의 그러한 집단; 골수 B-1a 세포는 IgM을 분비하고 혈장 IgM 타이터6에크게 기여하며, 복막 B-1a 세포는 항상성에서 낮은 수준의 IgM 분비를 가지며 대신 선천적 톨-유사 수용체(TLR) 또는 사이토카인 매개 신호를 통해7,8,9,활성화될 수 있으며, 70 , 70 , 70 , 70 ,70. B-1a 세포 IgM 항체는 병원균, 세포자멸 세포 및 산화된 LDL에 존재하는 산화 특이적 에피토프(OSE)를 인식하고, OSE에 결합하는 IgM은 죽상동맥경화증 과 같은 질병에서 염증성 하류 신호를 방지할 수 있다11. 따라서, 골수와 같은 부위로의 후막 B-1a 세포 이동을 증가시켜 IgM 생산을 증가시키는 전략이 치료적으로 유용할 수 있다. 그러나, 이러한 전략에 대 한 중요 한 대상 및 세포 유형 특정, 오프 타겟 효과 면역 기능 또는 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
여기서 우리는 1차 뮤린 B-1a 세포에서 CXCR4의 표적화 및 장기 과발현에 대한 방법을 설명하고 세포 이동 및 기능적 IgM 항체 생산을 시각화하기 위한 후속 입양 전달을설명한다(도 1). 1 차적인 B 세포의 유전 조작은 형질전환된 세포주의 형질전환에 비해 낮은 형광 효율성에 의해 제한됩니다. 그러나, 형질전환된 세포주들이1차 세포(12,,13)로부터현저하게 이탈할 수 있기 때문에, 1차 세포의 사용은 정상 생리학에 보다 밀접하게 부합하는 결과를 제공할 가능성이 높다. 몇몇 기술은 레트로바이러스 전달, 아데노바이러스 전달, 지방흡입, 또는 세포 건강에 미치는 영향의 다양한 수준을 가지는 전기천공 기반 형질감염을 포함하는 1차 뮤린 B 세포에서유전자 전달을 위해 기술되었다13,,14,,15. 다음 방법은 레트로바이러스 전달을 활용하여 세포 생존율에 최소한의 영향을 미치면서 >30%의 적절한 유전자 전달 효율을 산출하였다. 앞서 설명한 레트로바이러스 를 사용하여 생성된 CXCR4-뮤린 줄기세포 바이러스-내부 리보솜 진입 부위-녹색 형광 단백질(MSCV-IRES-GFP; MigR1)16,마우스 CXCR4 유전자가 서브클로론된 4. MigR1(대조군(Ctl)-GFP) 및 CXCR4-GFP 레트로바이러스 입자는 이전에 발표된 프로토콜4,,14에기재된 바와 같이 칼슘 인산염 형질감염을 사용하여 생성되었다.
성공적으로 변환된 B-1a 세포를 정맥내 림프구 결핍Rag1-/- 마우스로 옮겼다. 기증자 및 수용자 마우스 는 또한 아포리포프로테인 E (ApoE) 유전자의 녹아웃을 포함, 이는 증가 OSE 축적 및 동맥 경화증의 결과, 따라서 생체 내 B-1 세포 활성화 및 IgM 생산을위한 모델을 제공. 더욱이, 기증자 및 수용자 마우스는 CD45 동형에서 달랐다; 공여자 B-1 세포는 CD45.1+ApoE-/- 마우스로부터 왔고Rag1-/- CD45.2+ApoE-/- 수용자로 옮겨졌다. 이는 유세포분석 동안 B 세포 마커에 대한 추가적인 얼룩을 가할 필요 없이 수용자 CD45.2 B 세포로부터 의 기증자 CD45.1의 분화를 허용했다. 여기에 제공된 결과는 B-1a 세포에 대한 표적 CXCR4 과발현이 B-1a 세포의 증가된 능력과 연관되어 골수로 이동하는 것을 보여 주며, 이는 증가된 혈장 항 OSE IgM과 연관되어 있다. 우리는 또한 부정적인 선택을 통해 후막 B-1 세포의 농축을위한 방법을 제공하고 효율적인 전달을위한 B-1 세포 활성화의 요구 사항을 입증합니다. 이 방법은 B-1a 세포 이동, 표현형 또는 기능에 대한 단백질 과발현의 효과를 연구하기 위해 다른 레트로바이러스 구조에 적응될 수 있다. 더욱이, CD45.1 대 CD45.2 동형 구별의 사용은 이론적으로 내인성 B 세포를 포함하는 그밖 면역 충분한 뮤린 모형으로 전송을 허용할 수 있었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제공된 방법은 안정적이고 비교적 효율적인 1차 B-1a 세포 유전자 전달, 생체 내 입양 전달, 주입된 세포의 식별 및 국소화를 가능하게 한다. 세포는 세포 전이 후 17주 동안 검출될 수 있었고 증가된 CXCR4 발현을 유지하였다. 레트로바이러스 매개 전달은 우리의 손에 있는 세포 생존에 최소한의 충격으로 1 차 적인 murine B-1a 세포의 30-40% transduction 효율성을 산출했습니다(그림 4e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, P01 HL055798의 프로젝트 3, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) 및 R01GM100776 (T.P. 벤더)에 의해 지원되었습니다. A. 우파디는 미국 심장 협회 전 박사 펠로우십 16PRE30300002 및 5T32AI007496-20의 지원을 받았습니다. 우리는 그들의 우수한 기술 지원을 위한 버지니아 흐름 세포 분석 코어의 대학에서 조앤 라니건, 마이크 솔가, 클로드 츄에게 감사드립니다.
Materials
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
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