Caractérisation des structures amyloïdes dans le vieillissement C. Elegans à l’aide de l’imagerie à vie de fluorescence
Summary
L’imagerie à vie de fluorescence surveille, quantifie et distingue les tendances d’agrégation des protéines dans les modèles vivants, vieillissants et stressés de la maladie de C. elegans.
Abstract
Les fibrilles amyloïdes sont associées à un certain nombre de maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington, la maladie de Parkinson ou la maladie d’Alzheimer. Ces fibrilles amyloïdes peuvent séquestrer des protéines métastables endogènes ainsi que des composants du réseau de protéostasie (PN) et exacerber ainsi les mauvais pliages de protéine dans la cellule. Il existe un nombre limité d’outils disponibles pour évaluer le processus d’agrégation des protéines amyloïdes chez un animal. Nous présentons un protocole pour la microscopie à vie de fluorescence (FLIM) qui permet la surveillance ainsi que la quantification de la fibrilisation amyloïde dans des cellules spécifiques, telles que les neurones, d’une manière non invasive et avec la progression du vieillissement et sur la perturbation de le PN. La FLIM est indépendante des niveaux d’expression du fluorophore et permet une analyse du processus d’agrégation sans autre coloration ni blanchiment. Les fluorophores sont étanchéités lorsqu’elles sont à proximité des structures amyloïdes, ce qui entraîne une diminution de la durée de vie de la fluorescence. L’étanchéité est directement corrélée avec l’agrégation de la protéine amyloïde. FLIM est une technique polyvalente qui peut être appliquée pour comparer le processus de fibrilisation de différentes protéines amyloïdes, stimuli environnementaux, ou des antécédents génétiques in vivo d’une manière non invasive.
Introduction
L’agrégation protéique se produit à la fois dans le vieillissement et la maladie. Les voies qui mènent à la formation et au dépôt de grands amyloïdes ou d’inclusions amorphes sont difficiles à suivre et leur cinétique est tout aussi difficile à démêler. Les protéines peuvent se tromper en raison de mutations intrinsèques dans leurs séquences de codage, comme dans le cas des maladies génétiques. Les protéines se déplient également parce que le réseau de protéostasie (PN) qui les maintient solubles et correctement pliés est altéré, comme cela arrive pendant le vieillissement. Le PN comprend les chaperons moléculaires et les machines de dégradation et est responsable de la biogenèse, le pliage, le trafic et la dégradation des protéines1.
C. elegans est apparu comme un modèle pour étudier le vieillissement et la maladie en raison de sa courte durée de vie, la nature isogénique, et la facilité de manipulation génétique. Plusieurs souches transgéniques C. elegans qui expriment des protéines pathogènes humaines dans les tissus vulnérables ont été créées. Fait important, bon nombre des souches contenant des protéines sujettes à l’agrégation récapitulent la marque des troubles amyloïdes, la formation de grandes inclusions. Grâce au corps transparent de C. elegans, ces agrégats peuvent être visualisés in vivo, non invasivement et nontructivement2. Générer n’importe quelle protéine d’intérêt (POI) dans la fusion avec un fluorophore permet d’étudier ses emplacements, le trafic, le réseau d’interaction, et le destin général.
Nous présentons un protocole pour surveiller l’agrégation des protéines pathogènes dans la microscopie imageuse vivante et vieillissante de C. eleganpar l’intermédiaire de la microscopie imageuse à vie de fluorescence (FLIM). FLIM est une technique puissante basée sur la durée de vie d’un fluorophore, plutôt que sur ses spectres d’émission. La durée de vie (tau,) est définie comme le temps moyen requis par un photon pour se décomposer de son état excité de retour à son état au sol. La durée de vie d’une molécule donnée est calculée avec la technique de domaine temporel du comptage du photon unique en corrélation temporelle (TCSPC). Dans TCSPC-FLIM, la fonction de désintégration fluorescente est obtenue en excitant le fluorophore avec des impulsions laser courtes et à haute fréquence et en mesurant les heures d’arrivée du photon émis à un détecteur en ce qui concerne les impulsions. Lors de la numérisation d’un échantillon, un tableau de données tridimensionnel est créé pour chaque pixel : le tableau comprend des informations sur la distribution des photons dans leurs coordonnées spatiales x,y et leur courbe de désintégration temporelle. Un échantillon donné devient donc une carte des vies révélant des informations sur la structure de la protéine, la liaison et l’environnement3,4. Chaque protéine fluorescente possède une durée de vie intrinsèque et précisément définie, généralement de quelques nanosecondes (ns), dépendante de ses propriétés physiochimiques. Fait important, la durée de vie d’un fluorophore est indépendante de sa concentration, de son intensité fluorescente et de la méthodologie d’imagerie. Cependant, au sein d’un système biologique, il peut être affecté par des facteurs environnementaux tels que le pH, la température, les concentrations d’ions, la saturation en oxygène et ses partenaires d’interaction. Les durées de vie sont également sensibles aux changements structurels internes et à l’orientation. Le fusion d’un fluorophore à un POI entraîne un changement dans sa vie et, par conséquent, des informations sur le comportement de la protéine fusionnée. Lorsqu’un fluorophore est entouré ou encapsulé dans un environnement étroitement lié, comme les feuilles bêta antiparallel d’une structure amyloïde, il perd de l’énergie de façon non radiative, un processus connu sous le nom d’étanchéité5. L’étanchéité du fluorophore entraîne un raccourcissement de sa durée de vie apparente. Lorsqu’elle est soluble, la durée de vie d’une protéine restera plus proche de sa valeur d’origine et plus élevée. En revanche, quand une protéine commence à s’agréger, sa durée de vie passera inévitablement à une valeur inférieure6,7. Par conséquent, il devient possible de surveiller la propension à l’agrégation de toute protéine amyloïde-formant à différents âges dans la vie C. elegans.
Ici, nous décrivons un protocole pour analyser l’agrégation d’une protéine de fusion comprenant différentes étendues de polyglutamine (CAG, Q) (Q40, Q44, et Q85). Nous physions comment la technique peut être appliquée également à différents fluorophores, tels que la protéine fluorescente cyane (PCP), la protéine fluorescente jaune (YFP) et la protéine fluorescente rouge monomérique (mRFP); et dans tous les tissus de C. elegans, y compris les neurones, les muscles et l’intestin. En outre, dans le contexte de la protéostasie, la FLIM est un outil très utile pour observer les changements lors de l’épuisement des chaperons moléculaires. Abattre l’un des principaux chaperons moléculaires, protéine de choc thermique 1 (hsp-1), via l’interférence de l’ARN produit un mauvais pliage prématuré des protéines. L’augmentation de la charge d’agrégation en raison du vieillissement, de la maladie, ou des chaperons déficients, est alors mesurée comme une diminution de la durée de vie de fluorescence.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici décrit une technique à base de microscopie pour identifier les espèces agrégées dans le système modèle C. elegans. FLIM peut caractériser avec précision la présence d’espèces agrégées et solubles fusionnées à un fluorophore par mesure de leurs caries de fluorescence à vie. Lorsqu’une protéine de fusion commence à agréger sa durée de vie moyenne enregistrée passera d’une valeur plus élevée à une valeur inférieurede 16. La propensio…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La souche muscle-Q40-MRFP fournie par la CCG, qui est financée par le Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440). Le neuronal-Q40-CFP était un bon cadeau du Morimoto Lab. Nous reconnaissons le DFG (KI-1988/5-1 à JK, neuroCure PhD fellowship par le Groupe d’excellence NeuroCure à MLP), EMBO (bourse à court terme à MLP) et la Société des biologistes (subventions de voyage à CG et MLP) pour le financement. Nous reconnaissons également l’installation d’imagerie par microscopie lumineuse avancée du Centre max Delbrack de médecine moléculaire de Berlin pour avoir fourni la configuration pour l’image des constructions YFP.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
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