אפיון מבני עמילואיד בהזדקנות C. אלגיה באמצעות הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית
Summary
הדמיה של מסכי החיים של הקרינה הפלואורסצנטית, כימות ומבדיל את נטיות הצבירה של חלבונים בחיים, הזדקנות, והדגיש מודלים של מחלות C.
Abstract
סיבים עמילואיד קשורים מספר מחלות ניווניות כגון הנטינגטון, פרקינסון, או אלצהיימר. העמילואיד הללו יכול להתאים חלבונים אנדוגניים, כמו גם רכיבים של רשת פרוטאוסטזיס (PN) ובכך להחריף את החלבון misfolding בתא. יש מספר מוגבל של כלים הזמינים כדי להעריך את תהליך הצבירה של חלבונים עמילואיד בתוך בעל חיים. אנו מציגים פרוטוקול עבור מיקרוסקופ לכל החיים של הזריחה (FLIM) המאפשר ניטור כמו גם כימות של העמילואיד בתאים ספציפיים, כגון נוירונים, בצורה לא פולשנית ועם ההתקדמות של הזדקנות על הפרטורציה של PN. FLIM אינה תלויה ברמות הביטוי של הפלואורוופפור ומאפשרת ניתוח של תהליך הצבירה ללא כתמים או הלבנה נוספים. Fluorophores הם מורהים כאשר הם בקרבת מבנים עמילואיד, אשר גורמת לירידה של תקופת החיים הפלואורסצנטית. הקוצ’ינג מתואם ישירות לצבירת חלבון ה-עמילואיד. FLIM היא טכניקה רב-תכליתית שניתן להחיל כדי להשוות את תהליך fibrilization של חלבונים עמילואיד שונים, גירויים סביבתיים, או רקע גנטי vivo באופן לא פולשני.
Introduction
צבירת חלבונים מתרחשת הן בהזדקנות והן במחלה. המסלולים להוביל היווצרות והתצהיר של amyloids גדול או אמורפיות קשה לעקוב אחר הקינטיקה שלהם הם דומים מאתגרת לפענח. חלבונים יכול להטעות בשל מוטציות פנימיות בתוך רצפי הקידוד שלהם, כמו במקרה של מחלות גנטיות. חלבונים גם misfold כי הרשת פרוטאוסטזיס (PN) שמשאיר אותם מסיסים ומקופל כראוי הוא לקוי, כפי שקורה במהלך ההזדקנות. ה-PN כולל מלווים מולקולריים וmachineries השפלה והוא אחראי על ביוגנזה, קיפול, סחר והשפלה של חלבונים1.
ג. אלגיה התפתחה כמודל לחקר הזדקנות ומחלות בשל תוחלת החיים הקצרה שלה, הטבע האיזוגני וקלות התפעול הגנטי. מספר זנים של C. אלגיה המבטאים את החלבונים הגורמים למחלות אנושיות ברקמות פגיעות נוצרו. חשוב מכך, רבים מבין הזנים המכילים חלבונים הנוטים לצבור לכידה של סימן ההיכר של הפרעות עמילואיד, היווצרות של הכללות גדולות. הודות לגוף השקוף של ה-“אלאלגיה” , ניתן לדמיין את האגרגטים האלה בvivo, באופן בלתי פולשני ובלתי מורגש2. יצירת חלבון כלשהו של עניין (פוי) ב פיוז ‘ ן עם fluorophore מאפשר לחקור את מיקומם, סחר, אינטראקציה ברשת, והגורל הכללי.
אנו מציגים פרוטוקול לנטר את צבירת החלבונים הגורמים למחלות בחיים ובהזדקנות באמצעות מיקרוסקופהדמיה מתקופת החיים הפלואורסצנטית (flim). FLIM היא טכניקה רבת עוצמה המבוססת על החיים של fluorophore ולא ספקטרום הפליטה שלה. החיים (טאו, τ) מוגדר כזמן הממוצע הנדרש על ידי פוטון להירקב מהמצב הנרגש שלו בחזרה למדינה הקרקע שלה. תקופת החיים של מולקולה נתונה מחושבת עם טכניקת הזמן-תחום של מתאם הפוטון בודד הזמן (TCSPC). ב TCSPC-FLIM, הפונקציה ריקבון פלורסנט מושגת על ידי מרגש fluorophore עם קצר, בתדר גבוה פולסים לייזר ומדידת זמני הגעתו של פוטון הנפלט גלאי ביחס לפולסים. בעת סריקת דוגמה, נוצר מערך נתונים תלת-מימדי עבור כל פיקסל: המערך כולל מידע על התפלגות הפוטונים בקואורדינטות x, y מרחבית ועקומת הדעיכה שלהם. דוגמה נתונה הופכת למפת תקופות חיים החושפת מידע על מבנה החלבון, הכריכה והסביבה3,4. כל חלבון פלורסנט בעל חיים מהותיים ומוגדרים בדיוק, בדרך כלל של כמה ננושניות (ns), התלויים במאפיינים הפיזיוכימיים שלו. וחשוב מכך, תקופת החיים של פלואורואופלפור אינה תלויה בריכוז שלה, בעוצמת הפלורסנט ובמתודולוגיה של הדמיה. עם זאת, בתוך מערכת ביולוגית, זה יכול להיות מושפע גורמים סביבתיים כגון pH, טמפרטורה, ריכוזי יונים, רווית חמצן, ואת השותפים אינטראקציה שלה. משך החיים רגיש גם לשינויים ולאוריינטציה פנימיים של המבנה. החדרת פלואורואופלפור ל-פוי גורמת לשינוי בתקופת חייו וכתוצאה מכך מידע על התנהגות החלבון התמזגו. כאשר fluorophore מוקף או כפוף בסביבה מאוגד היטב, כגון גיליונות בטא אנטי מקבילי של מבנה עמילואיד, הוא מאבד את האנרגיה בלתי-קרינה, תהליך המכונה מקוצ’ינג5. קוצ’ינג של fluorophore תוצאות קיצור של החיים לכאורה שלה. כאשר מסיסים, חיי החלבון יישארו קרובים יותר לערך המקורי, הגבוה יותר. לעומת זאת, כאשר חלבון מתחיל לצבור, החיים שלו באופן בלתי נמנע משתנה לערך נמוך יותר6,7. לכן, ניתן לנטר את הנטייה של הצבירה של כל חלבון היוצר עמילואיד בגילאים שונים בחיים C. אלגיה.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הצבירה של חלבון היתוך המורכב polyglutamine שונים (הקאג, Q) מותח (Q40, Q44, ו Q85). אנו ממחישים כיצד ניתן ליישם את הטכניקה באופן שווה לצבעים שונים, כגון חלבון פלורסנט כחול (CFP), חלבון פלורסנט צהוב (YFP) ו חלבון פלורסנט monomeric (mRFP); ובכל הרקמות של הג, כולל הנוירונים, השרירים והמעיים. יתר על כן, בהקשר של פרוטאוסטזיס, FLIM הוא כלי שימושי מאוד להתבונן שינויים על דלדול של מלווים מולקולריים. הורסים את אחד מהמלווים המולקולריים המרכזיים, חלבון הלם חום 1 (hsp-1), באמצעות הפרעות RNA מפיקה חוסר מוקדמות של חלבונים. הגידול בעומס מצבור כתוצאה של הזדקנות, מחלות או מלווים לקויה, נמדד אז כירידה בחיים הפלואורסצנטית.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר טכניקה מבוססת-מיקרוסקופית לזיהוי מינים צבורים במערכת המודל של C. אלגיה . FLIM יכולה לאפיין במדויק את הנוכחות של מינים צבורים ומסיסים התמזגו לפלואורופור באמצעות מדידה של תקופת החיים הפלואורסצנטית שלהם. כאשר חלבון היתוך מתחיל לצבור חיים ממוצע מוקלט שלה יעבור מגב…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המתח שרירים-Q40-mRFP שסופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). הQ40-CFP היה מתנה מהסוג של מעבדת מורימוטו. אנו מכירים DFG (KI-1988/5-1 לייק, מלגת נוירוקיור PhD על ידי אשכול נוירוקיור של מצוינות to MLP), EMBO (האחווה לטווח קצר MLP) והחברה של ביולוגים (מענקים נסיעה ל-CG ו MLP) עבור מימון. אנו מכירים גם את מתקן הדימות המתקדם של מיקרוסקופ האור במרכז מקס דלבריק לרפואה מולקולרית, ברלין, על מנת לספק את הכיוונון לדימוי המבנים של YFP.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58 (2016).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging – techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
- Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
- Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
- Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687 (2013).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
- Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
- Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
- Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
- Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
- Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).
