फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग का उपयोग करके एजिंग सी एलिगेंस में एमीलॉयड संरचनाओं का लक्षण वर्णन
Summary
फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग पर नज़र रखता है, मात्रा और रहने में प्रोटीन की एकत्रीकरण प्रवृत्तियों को अलग करता है, उंर बढ़ने, और सी elegans रोग मॉडल पर बल दिया ।
Abstract
एमिलॉयड फाइब्रिल्स हंटिंगटन, पार्किंसंस या अल्जाइमर रोग जैसे कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से जुड़े होते हैं। ये एमिलॉयड फाइब्रिल्स एंडोजेनस मेटास्टेबल प्रोटीन के साथ-साथ प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क (पीएन) के घटकों को अलग कर सकते हैं और इस तरह कोशिका में प्रोटीन गलत तह को बढ़ा सकते हैं। एक जानवर के भीतर एमिलॉयड प्रोटीन की एकत्रीकरण प्रक्रिया का आकलन करने के लिए सीमित संख्या में उपकरण उपलब्ध हैं। हम फ्लोरेसेंस लाइफटाइम माइक्रोस्कोपी (FLIM) के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो विशिष्ट कोशिकाओं में एमिलॉयड फाइब्रिलाइजेशन की निगरानी के साथ-साथ न्यूरॉन्स जैसी विशिष्ट कोशिकाओं में एमिलॉयड फाइब्रिलाइजेशन की मात्रा की अनुमति देता है, एक गैर-आक्रामक तरीके से और उम्र बढ़ने की प्रगति के साथ और क्षोभ पर पीएन। FLIM फ्लोरोफोर के अभिव्यक्ति के स्तर से स्वतंत्र है और किसी भी आगे धुंधला या ब्लीचिंग के बिना एकत्रीकरण प्रक्रिया का विश्लेषण सक्षम बनाता है । फ्लोरोफोरस को तब बुझाया जाता है जब वे एमिलॉयड संरचनाओं के करीब होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरेसेंस जीवनकाल में कमी आती है। शमन सीधे एमिलॉयड प्रोटीन के एकत्रीकरण के साथ संबंधित है। FLIM एक बहुमुखी तकनीक है जिसे गैर-आक्रामक तरीके से वीवो में विभिन्न एमिलॉयड प्रोटीन, पर्यावरण उत्तेजनाओं या आनुवंशिक पृष्ठभूमि की फाइब्रिलाइजेशन प्रक्रिया की तुलना करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
प्रोटीन एकत्रीकरण उम्र बढ़ने और बीमारी दोनों में होता है। बड़े एमिलॉयड या असंगत समावेशन के गठन और जमाव का कारण बनने वाले रास्ते का पालन करना मुश्किल है और उनके गतिज इसी तरह को सुलझाना चुनौतीपूर्ण हैं। प्रोटीन आनुवंशिक रोगों के मामले में, उनके कोडिंग दृश्यों के भीतर आंतरिक उत्परिवर्तन के कारण गलत गुना कर सकते हैं। प्रोटीन भी गलत गुना क्योंकि प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क (पीएन) जो उन्हें घुलनशील और ठीक से जोड़ता रहता है, बिगड़ा हुआ है, जैसा कि उम्र बढ़ने के दौरान होता है। पीएन में आणविक चपरासी और क्षरण मशीनें शामिल हैं और बायोजेनेसिस, तह, तस्करी और प्रोटीन1के क्षरण के लिए जिम्मेदार है।
सी एलिगेंस अपनी छोटी उम्र, आइसोजेनिक प्रकृति और आनुवंशिक हेरफेर में आसानी के कारण उम्र बढ़ने और बीमारी का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में उभरा है । कई सी एलिगेंस ट्रांसजेनिक उपभेदों कि कमजोर ऊतकों में मानव रोग के कारण प्रोटीन व्यक्त बनाया गया है । महत्वपूर्ण बात यह है कि एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन वाले कई उपभेद एमिलॉयड विकारों की पहचान, बड़े समावेशन के गठन को फिर से दोहराते हैं। सी एलिगेंस के पारदर्शी शरीर के लिए धन्यवाद, इन समुचुओं को वीवो, गैर-आक्रामक और गैर-विनाशकारी रूप से2में कल्पना की जा सकती है। फ्लोरोफोर के साथ संलयन में ब्याज (पीओआई) का कोई प्रोटीन उत्पन्न करना इसके स्थानों, तस्करी, इंटरैक्शन नेटवर्क और सामान्य भाग्य की जांच करने की अनुमति देता है।
हम फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) के माध्यम से रहने वाले और उम्र बढ़ने सी एलिगनएस में रोग पैदा करने वाले प्रोटीन के एकत्रीकरण की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। FLIM एक शक्तिशाली तकनीक है जो अपने उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के बजाय फ्लोरोफोर के जीवनकाल पर आधारित है। जीवन भर (ताऊ, α) औसत एक फोटॉन के लिए आवश्यक समय के रूप में परिभाषित किया गया है अपने उत्तेजित राज्य से अपनी जमीन राज्य को वापस क्षय । दिए गए अणु के जीवनकाल की गणना समय-सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती (टीसीएसपीसी) की समय-डोमेन तकनीक के साथ की जाती है। टीसीएसपीसी-एफआईआईएल में, फ्लोरोसेंट क्षय समारोह को फ्लोरोफोर को कम, उच्च आवृत्ति लेजर दालों के साथ रोमांचक करके प्राप्त किया जाता है और दालों के संबंध में एक डिटेक्टर के लिए उत्सर्जित फोटॉन के आगमन के समय को मापने के लिए प्राप्त किया जाता है। एक नमूने को स्कैन करते समय, प्रत्येक पिक्सेल के लिए एक त्रि-आयामी डेटा सरणी बनाई जाती है: सरणी में उनके एक्स, वाई स्थानिक निर्देशांक और उनके लौकिक क्षय वक्र में फोटॉनों के वितरण के बारे में जानकारी शामिल है। एक दिया नमूना इसलिए प्रोटीन की संरचना, बाध्यकारी, और पर्यावरण3,,4के बारे में जानकारी खुलासा जीवन काल का एक नक्शा बन जाता है । प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन में एक आंतरिक और ठीक परिभाषित जीवनकाल होता है, आमतौर पर कुछ नैनोसेकंड (एनएस) का होता है, जो इसके फिजियोकेमिकल गुणों पर निर्भर होता है। महत्वपूर्ण बात, फ्लोरोफोर का जीवनकाल इसकी एकाग्रता, फ्लोरोसेंट तीव्रता और इमेजिंग पद्धति से स्वतंत्र है। हालांकि, एक जैविक प्रणाली के भीतर, यह पीएच, तापमान, आयन सांद्रता, ऑक्सीजन संतृप्ति, और उसके बातचीत भागीदारों जैसे पर्यावरणीय कारकों से प्रभावित हो सकता है। जीवन काल भी आंतरिक संरचनात्मक परिवर्तन और अभिविन्यास के प्रति संवेदनशील हैं। पीओआई के लिए फ्लोरोफोर को फ्यूज करने के परिणामस्वरूप इसके जीवनकाल में बदलाव होता है और इसके परिणामस्वरूप फ्यूजकिए गए प्रोटीन के व्यवहार के बारे में जानकारी होती है। जब एक फ्लोरोफोर को कसकर बंधे वातावरण में घिरा या समझाया जाता है, जैसे कि एमिलॉयड संरचना की एंटीसमान बीटा शीट, यह ऊर्जा को गैर-रेडिएटिव रूप से खो देता है, एक प्रक्रिया जिसे शमन5के रूप में जाना जाता है। फ्लोरोफोर की शमन के परिणामस्वरूप इसके स्पष्ट जीवनकाल का एक छोटा होता है। जब घुलनशील, एक प्रोटीन के जीवनकाल अपने मूल, उच्च मूल्य के करीब रहना होगा । इसके विपरीत, जब एक प्रोटीन कुल शुरू होता है, तो उसका जीवनकाल अनिवार्य रूप से कम मूल्य6,,7में बदल जाएगा। इसलिए, जीवित सी एलिगेंसमें विभिन्न उम्र में किसी भी एमिलॉयड बनाने वाले प्रोटीन की एकत्रीकरण प्रवृत्ति की निगरानी करना संभव हो जाता है।
यहां हम एक संलयन प्रोटीन के एकत्रीकरण का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें विभिन्न पॉलीग्लूटामाइन (सीएजी, क्यू) फैला (Q40, Q44 और Q85) शामिल हैं। हम वर्णन करते हैं कि तकनीक को विभिन्न फ्लोरोफोरस पर समान रूप से कैसे लागू किया जा सकता है, जैसे सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी), येलो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) और मोनोमेरिक रेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एमआरएफपी); और सी एलिगन्सके सभी ऊतकों में, न्यूरॉन्स, मांसपेशियों और आंत सहित। इसके अलावा, प्रोटेओस्टेसिस के संदर्भ में, FLIM आणविक चपरासी की कमी पर परिवर्तन ों का निरीक्षण करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है। आरएनए हस्तक्षेप के माध्यम से प्रमुख आणविक चपरासियों में से एक, हीट शॉक प्रोटीन 1(एचएसपी-1)को दस्तक देना प्रोटीन के समय से पहले गलत गुना पैदा करता है। उम्र बढ़ने, बीमारी, या कमी वाले चैपरोन के परिणामस्वरूप एकत्रीकरण भार में वृद्धि को फ्लोअरसेंस जीवनकाल में कमी के रूप में मापा जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सी एलिगेंस मॉडल सिस्टम में एकत्रित प्रजातियों की पहचान करने के लिए माइक्रोस्कोपी आधारित तकनीक का वर्णन करता है । FLIM सही दोनों एकत्रित और घुलनशील प्रजातियों की उपस्थिति की …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सीजीसी द्वारा प्रदान की जाने वाली मांसपेशी-Q40-mRFP तनाव, जिसे एनआईएच कार्यालय ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। न्यूरोनल-क्यू40-सीएफपी मोरिमोटो लैब का एक तरह का तोहफा था । हम डीएफजी (जेके को केआई-1988/5-1, न्यूरोक्योर पीएचडी फेलोशिप को एक्सीलेंस क्लस्टर ऑफ एक्सीलेंस द्वारा एमएलपी, एम्बो (एमएलपी को शॉर्ट टर्म फेलोशिप) और फंडिंग के लिए बायोलॉजिस्ट्स (सीजी और एमएलपी को यात्रा अनुदान) की कंपनी स्वीकार करते हैं । हम वाईएफपी निर्माण की छवि को सेटअप प्रदान करने के लिए मैक्स डेलब्रुक सेंटर फॉर मॉलिक्यूलर मेडिसिन, बर्लिन में उन्नत लाइट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सुविधा को भी स्वीकार करते हैं।
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
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